Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Under rekonstruktiv knogle- kirurgi, er suprafysiologiske mængder af vækstfaktorer empirisk fyldt på stilladser at fremme vellykket knoglefusion. Store doser af højpotente biologiske midler er påkrævet på grund af vækstfaktor ustabilitet som følge af hurtig enzymatisk nedbrydning samt carrier ineffektivitet i lokalisering tilstrækkelige mængder af vækstfaktor på implantat sites. Derfor kunne strategier, der forlænger stabiliteten af vækstfaktorer, såsom BMP-2 / NELL-1, og styrer deres løsladelse faktisk sænke deres effektive dosis og dermed mindske behovet for større doser under fremtidige knogle regenerering operationer. Dette vil igen reducere bivirkninger og vækstfaktor-omkostninger. Self-samlet PEC er blevet fremstillet for at give bedre kontrol med BMP-2 / NELL-1 levering via heparin bindende og yderligere potenserer vækstfaktor bioaktivitet ved at øge in vivo-stabilitet. Her illustrerer vi enkelhed PEC fabrikation som hjælper i levering perry af en række forskellige vækstfaktorer under rekonstruktive knogle kirurgi.
Forekomsten af pseudoarthrose er blevet rapporteret at være så høj som 10 til 45% i degenerative spinal fusion og revision spinal kirurgi 1. At reducere antallet af Pseudartrose under columna fusion og andre rekonstruktive knogle kirurgi, er blevet indført osteogene vækstfaktorer, såsom BMP-2, Nell-1 1 og blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) at fremme de novo osteogenese. Blandt disse, BMP-2 er et populært valg for spinal fusion 2. Selvom styrken af BMP-2 ved inducering og lette ny knogledannelse er blevet veletableret 3; klinisk signifikante komplikationer såsom heterotop knogledannelse, seroma og hæmatomdannelse, inflammatorisk respons, radiculitis, corpus vertebrae osteolyse og retrograd ejakulation fortsat være spørgsmål af interesse på grund af de suprafysiologiske anvendte mængder 4,5.
Derfor sænke dosen af BMP-2 fortsat en relevant strategi ind påfrister at minimere bivirkninger. Desuden er effektive bærersystemer kræves for at undertrykke den initielle afgivelse frigivelse af BMP-2 observeret i moderne collagensvamp bærersystemer og yderligere forbedre forlænget og lokal afgivelse af denne potente cytokin. Lag-på-lag selvsamling af vekslende kationiske og anioniske polyelektrolytter kan anvendes som en afstemmelig metode til at opbygge polyelektrolytkomplekser på overfladen af stillads matrixer eller implanterbare materialer 6. I denne henseende har heparin (kendt for at have den største negative ladningsdensitet for alle biologiske agenser) blevet anerkendt til effektivt binde med en række vækstfaktorer via elektrostatiske og heparinbindende domæner. Faktisk har heparin blevet vist at forlænge halveringstiden og således potentiere bioaktiviteten af flere vækstfaktorer.
Baseret på dette, vores gruppe tilpasset et lag-på-lag selv-samling protokol til fabrikere en heparin-baserede polyelektrolyt kompleks (PEC), at belastninger og bevarer bioaktiviteter af osteogene vækstfaktorer under immobilisering 7,8. Alginat mikroperle kerne blev fremstillet ved tværbinding α-L-guluronat (G) rester af alginat med divalent kation calcium- eller strontiumioner. Alginatet kerne er en bionedbrydelig scaffold matrix; som efter implantering, er det resorberes i fusionen seng giver plads til knogleindvækst. Poly-L-lysin (PLL) eller protamin anvendes som den kationiske lag til interlace med både stilladset matrix (i dette tilfælde, alginat mikroperle bærer kerne) og det negativt ladede heparin; mens de anioniske heparin lag tjener til at stabilisere og lokalisere indlæst vækstfaktorer. Den tredobbelte lag PEC har vist sig at øge væksten faktor lasteevne i et porcint model 9. For nylig er PEC bærere vist sig at kunne reducere den effektive dosis af BMP-2 med mindst 20-fold i rotter 10 og svin modeller af spinalfusion 8.
ntent "> Her rapporterer vi metoder til opdigte PEC'er for øget vækst faktor levering i spinal fusion og de andre rekonstruktive knogle kirurgi ved hjælp BMP-2 som en model osteogen vækstfaktor.Denne protokol viser en fremgangsmåde til fremstilling af PEC'er gennem lag-på-lag selv-samling. Lag-på-lag struktur visualiseres under anvendelse af fluorescerende analoger af protamin, heparin, BMP-2 og NELL-1 og konfokal mikroskopi. Optagelse og frigive forsøg viser, at heparin på PEC medierer osteogen vækstfaktor optagelse og frigivelse. Optagelsen effektivitet PEC metoden er: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. PEC bærer har en bedre modulering af NELL-1 (20%) frigivelse sammenlignet med en ren ov…
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
24 well plate | Cell Star | 662160 | |
96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
DMEM | Gibco | 12320 | |
BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
Incubator | Binder | C8150 | |
MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
Shaker | Labnet | S2025 | |
Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
Spatula | 3dia | ||
5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |