الانطباع علم الخلايا من منطقة ممسحة غطاء
Summary
We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.
Abstract
Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.
Introduction
الجفن العلوي البشري ينفذ حوالي 10،000 يومض كل يوم 1، مع مجرد 1 – المنطقة الملتحمة 2 مم الضيقة معارضة العالم العين. بسبب حركة المسح له خلال طرفة، وقد أطلق على هذا الجزء من هامش غطاء "غطاء ممسحة" المنطقة 2. ومن المفترض أن يتم زيادة الاحتكاك في هذه المنطقة خلال الوميض المعتاد، وذلك بسبب الغطاء محو أنحاء العالم. هذا قد لعب دورا هاما في راحة العين. يضعون العدسات اللاصقة في تجربة معينة عدم الراحة في العين وهذا هو واحد من الأسباب الرئيسية لوقف عدسة ارتداء 3. عندما يتم وضع العدسات اللاصقة على العين، وقد تبين أن معامل الاحتكاك بين المواد العدسة وسطح العين لتغيير 4. هناك أدلة تشير إلى أن أعراض جفاف يمكن أن تكون ذات صلة في هذا الاحتكاك تغير 2،5،6.
هذا الارتباط يمكن أيضا أن تنعكس في الظواهر الملحوظة سريريا، ولا سيما واي غطاءفي epitheliopathy (LWE)، وتسمى أيضا الجفن العلوي هامش تلطيخ (ULMS) 6. LWE هو علامة مبكرة من تهيج العين ومؤشرا محتملا لمرض العين الجافة. لوحظ ويقاس تلطيخ حيوي من المناطق حافة الجفن العلوي والسفلي. في حين أن هذا نظام الدرجات 2 و صحة السريرية (أي، والارتباط مع أعراض ذاتية) لا تزال قيد المناقشة، لا يزال عدم الراحة في العين معضلة بالنسبة للأطباء والعلماء على حد سواء، والأهم، مصدر إزعاج للمرضى.
حتى تاريخه، لا يعرف إلا القليل عن الاختلافات سريريا ذات الصلة في (شبه) التشريح الخلوي وعلم وظائف الأعضاء من منطقة ممسحة غطاء 7 وتقرير واحد فقط يجعل من استخدام أساليب الخلوي 8. وقد استخدمت الانطباع علم الخلايا (IC) لأكثر من 40 عاما لجمع الخلايا من سطح الظهارية من الصلبية أو الملتحمة الجفنية من خلال تطبيق غشاء 9،10. عند إزالتها، فإن الخلايا الملتصقة تخضع جتلطيخ ytological والتصوير المجهري. نظرا للاختلافات التشريحية والخلوية في المنطقة ممسحة غطاء، وهذا الأسلوب يتطلب الأمثل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تنفيذ الخلايا الانطباع عادة على الملتحمة الصلبية، وذلك باستخدام الأغشية استر السليلوز مختلطة. يتم قطع العينات إلى حجم من صفائح المواد السائبة، تعقيم، تطبيق وإزالتها من على سطح الملتحمة باستخدام ملقط. باستخدام نفس المواد الغشاء، تم تصميم جهاز IC التي تسيطر عليها …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge our colleague Dr. Jalaiah Varikooty who provided insight and expertise on the topic of the lid wiper, that greatly assisted this research.
Materials
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referências
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx’s line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. . Confocal microscopy. , 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
