Impressie Cytologie van het deksel Wiper Area
Summary
We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.
Abstract
Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.
Introduction
De menselijke bovenste ooglid voert ongeveer 10.000 knippert elke dag 1, met slechts een 1-2 mm smalle conjunctivale regio tegen de oogbol. Door het wissen beweging tijdens het knipperen, is dit gedeelte van het ooglid is genoemd het "deksel wiper" gebied 2. Aangenomen wordt dat de wrijving tijdens gewone knipperend in dit gebied verhoogd, door het deksel vegen over de hele wereld. Dit kan een belangrijke rol spelen bij oculaire comfortabel. Contactlensdragers met name ervaring oculair ongemak en dit is een van de belangrijkste redenen voor stopzetting van de lens te dragen 3. Wanneer een contactlens geplaatst op het oog, is de wrijvingscoëfficiënt tussen het lensmateriaal en het oogoppervlak aangetoond veranderen 4. Er zijn aanwijzingen dat de droogte de symptomen kunnen worden gerelateerd aan deze veranderde wrijving 2,5,6.
Deze vereniging kan ook tot uiting komen in klinisch waarneembare verschijnselen, met name deksel wiper epitheliopathie (LWE), ook wel bovenste ooglid marge kleuring (ULMS) 6. LWE is een vroeg teken van oogirritatie en een potentiële voorspeller voor droge oogziekte. Opgemerkt wordt gemeten en de vitale kleuring van de bovenste en onderste ondermargegebieden deksel. Hoewel dit beoordelingssysteem 2 en de klinische geldigheid (dat wil zeggen, correlatie met subjectieve symptomen) zijn nog in discussie, oculair ongemak blijft een raadsel voor zowel clinici en wetenschappers en, belangrijker nog, een ongemak voor de patiënten.
Tot op heden is er weinig bekend over klinisch relevante verschillen in de (sub-) cellulaire anatomie en fysiologie van het deksel ruitenwisser gebied 7 en slechts één rapport maakt gebruik van cytologisch methoden 8. Indruk cytologie (IC) is gebruikt meer dan 40 jaar om cellen te verzamelen van het epitheliale oppervlak van de bulbaire conjunctiva of tarsale door toepassing van een membraan 9,10. Na verwijdering van de hechtende cellen ondergaan cytological kleuring en microscopische beeldvorming. Door de anatomische en cellulaire verschillen in het deksel ruitenwisser regio, deze techniek vereist optimalisatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Impression cytologie wordt typisch uitgevoerd op de bulbaire conjunctiva, die gemengde cellulose-ester membranen. Monsters worden op maat gesneden van bulkmateriaal bladen gesteriliseerd, aangebracht en verwijderd uit de conjunctivale oppervlak met behulp van een tang. Met dezelfde membraanmateriaal werd een piston IC apparaat onlangs ontworpen om de oppervlakte geometrie van de bulbaire conjunctiva passen en constant hoge druk tussen 13 toepassingen. Deze benaderingen zijn inefficiënt voor de smalle, geboge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge our colleague Dr. Jalaiah Varikooty who provided insight and expertise on the topic of the lid wiper, that greatly assisted this research.
Materials
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referências
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx’s line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. . Confocal microscopy. , 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
