House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
אוזן בית מכון-איברים של 1 קורטי (HEI-OC1) תאים נגזרים מאיבר השמיעה של 1,2 עכבר מהונדס. דגירה של כל תא מעכבר מהונדס זה על 33 ° C / 10% CO 2 (תנאי מתירני) גרם ביטוי של גן מנציחה שמפעיל בידול דה ושגשוגם מואץ; הזזת תאים ל -39 ° C / 5% CO 2 (תנאים שאינם מתירני) להביא לפגיעה התפשטות, בידול, לפחות במקרה של HEI-OC1, מוות של תאים 2,3.
תאי HEI-OC1 היו משובטים ומאופיינים במעבדה שלנו לפני למעלה מעשור, מחקרים ראשוניים הראו כי הם מביעים סמנים ספציפיים של תאי שיער שבלול, כגון פרסטין, 7 א שרירן, Atoh1, BDNF, calbindin ו calmodulin, אלא גם סמנים של תומכים תאים כמו connexin 26 ו הקולטן לגורם הצמיחה פיברובלסטים (FGF-R) 2. לכן, הוצע כי HEI-OC1 יכול לייצג common ובתאים עבור תאים חושיים ותמיכה של האיבר של קורטי 2. מחקרים מקבילים ספקו ראיות מוצקות לכך ארכיטיפי תרופות ototoxic כמו ציספלטין, גנטמיצין ו סטרפטומיצין מושרה הפעלת caspase-3 בתאים אלה, בעוד תרופות נחשבות בלתי ototoxic, כמו פניצילין, לא 2,3. לכן, שורת תא זו הוצעה כמערכת במבחנה כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים מעורבים ototoxicity ו להקרנה של ototoxicity הפוטנציאל או נכסי otoprotective של תרופות תרופתיות חדשות. ההערכה היא כי תאי HEI-OC1 שימשו יותר ממאה וחמישים מחקרים שפורסמו בעשר השנים האחרונות.
בעוד מסתכל ההשפעה הפרו-אפופטוטיים הפוטנציאל של תרופות שונות היה המטרה העיקרית של רוב המחקרים שכללו את שורות תאים, תהליכים בתא חשובים אחרים כמו autophagy והזדקנות החלו רק כדי להיחקר בתאי HEI-OC1 4-7. אנינה מחקר שנערך לאחרונה במעבדה שלנו 8, השתמשנו תאים HEI-OC1 לאסוף מערך מקיף של נתונים על מוות של תאים, הישרדות, התפשטות, הזדקנות ו autophagy המושרה על ידי תרופות פרמקולוגיות שונות תדירים במרפאה. אנחנו גם בהשוואה כמה מהתגובות של תאי HEI-OC1 עם אלו של HEK-293 (תאי כליה עובריים אנושיים) והלה (תאי אפיתל אדם) מקבלים טיפול זהה. התוצאות שלנו הצביעו על כך HEI-OC1 תאים להגיב על כל תרופה בצורה אופיינית, עם dose- ייחודי ורגיש תלוי זמן לפחות אחד המנגנונים נחקרים. גם הדגשנו כי מחקר כי פרשנות נכונה של תוצאות הניסוי תדרוש ביצוע מחקרים מקבילים עם יותר מאחד טכניקה 8.
במחקר אחר חקרנו את השימוש בתאי HEI-OC1 כדי להעריך את התגובה התפקודית של פרסטין, החלבון המנוע של תאי שיער חיצוניים שבלול (OHCs) 9 </sעד>. דיווחנו cytometry זרימה ומחקרים מיקרוסקופיית לייזר confocal על דפוס הביטוי פרסטין, כמו גם קיבול קוי (NLC) ומחקרים ההידוק תא-תיקון כל בתאים HEI-OC1 בתרבית בשעה מתירנית (P-HEI-OC1) והלא תנאי היתר (NP-HEI-OC1). התוצאות שלנו הצביעו על כך הוא ביטוי פרסטין סך קרום פלזמת גידול לוקליזציה באופן תלוי-זמן בתאי NP-HEI-OC1. מעניין, מצאנו גם כי גידול לוקליזציה פרסטין על קרום הפלזמה של תאי NP-HEI-OC1 בקורלציה עם ירידה Na + K + ATPase, אשר translocated מן קרום הפלזמה אל הציטופלסמה ללא שינויים משמעותיים ביטוי תא כולל. בנוסף, הראינו כי P-HEI-OC1 יש לתאים NLC חזק הקשורים פרסטין תפקוד מוטורי, אשר ירד כאשר הצפיפות של מולקולות פרסטין נוכחי קרום הפלזמה גדלה. בסך הכל, תוצאות אלו תומכות התועלת של HEI-OC1 תאים לחקור חלבוני שמיעה.
במאמר זה וידאו אנו מתארים כיצד תרבות תאי HEI-OC1, למה זה נוח להשתמש תאים גדלים בתנאי היתר (P-HEI-OC1) ללימודי cytotoxicity, איך להעריך את המנגנון / s של cytotoxicity-סמים ואיך לבצע מחקרים אלקטרו (למשל, תיקון- clamp, קיבול שאינו ליניארי (NLC)) לחקור תכונות פעילות של פרסטין, המנוע המולקולרי של OHCs שבלול.
בדוח זה אנו מתארים כיצד התרבות תאים HEI-OC1 ולהשתמש בהם כדי להעריך מנגנונים של רעילות סמים ולחקור תכונות פעילות של פרסטין, המנוע המולקולרי של OHCs שבלול. הנהלים הטכניים, עם זאת, הם כלליים מספיק כדי להתאים בקלות מחקרים שונים.
כל הפרוטוק?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |