Procedura per l'Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

Summary

Qui, vi presentiamo un protocollo per ottenere adattativa evoluzione laboratorio di microrganismi in condizioni che utilizzano la cultura chemostat. Inoltre, l'analisi genomica del ceppo evoluto è discusso.

Introduction

I microrganismi possono sopravvivere e di adattarsi ad ambienti diversi. Sotto stress grave, l'adattamento può avvenire attraverso l'acquisizione di fenotipi benefici da mutazioni genomiche casuali e la successiva selezione positiva ^1-3. Pertanto, le cellule microbiche in grado di adattarsi cambiando metabolica o reti di regolazione per una crescita ottimale, che viene definito "l'evoluzione adattativa". Recenti importanti tendenze microbici, come focolai di superbatteri e la comparsa di ceppi microbici resistenti, sono strettamente correlate a adattivo evoluzione in condizioni di stress. In condizioni di laboratorio definite, siamo in grado di studiare i meccanismi di evoluzione molecolare e anche controllare la direzione di evoluzione microbica per varie applicazioni. Diversamente organismi multicellulari, organismi unicellulari sono adatti all'evoluzione laboratorio adattativa (ALE) per i seguenti motivi: si rigenerano rapidamente, mantengono grandi popolazioni, ed è facile per creare e mantenere homambienti ogeneous. In combinazione con i recenti progressi nelle tecniche di sequenziamento del DNA e le tecnologie high-throughput, ALE permette l'osservazione diretta dei cambiamenti genomiche che portano a modifiche normative sistemici. dinamiche mutazionale e una diversità della popolazione sono anche osservabili. Strategie di ingegneria genetica può essere determinata dall'analisi di ceppi ALE ^4,5.

Cultura chemostat è un metodo utilizzato per ottenere cellule allo stato stazionario e aumentare la produttività nei processi di fermentazione ^6. terreno fresco viene aggiunto e brodo di coltura è raccolta durante il processo (quest'ultimo include medio e biomasse). Cultura chemostat A lungo termine, però, cambia la produttività dello stato stazionario della cultura e provoca l'accumulo di mutazioni spontanee e selezione durante la coltura (Figura 1a). Sotto varie pressioni selettive (fattori di stress), l'accumulo di mutazioni è migliorata. Un graduale aumento dello stress in un lungo periodo chemostat prevede una selezione continua di mutazioni che funzionano contro i fattori di stress indicati, quali temperatura, pH, pressione osmotica, nutrienti fame, ossidazione, prodotti tossici, ecc transfer Colony da un supporto solido e trasferimento seriale da un mezzo liquido (ripetuto cultura batch) permettono anche ai ricercatori di ottenere microrganismi evoluti (Figura 1B e 1C). Anche se la cultura chemostat richiede metodi complicati, la piscina della diversità (numero di repliche e dimensione della popolazione) è superiore a quello ottenuto con il trasferimento della colonia e le tecniche di trasferimento seriale. L'esposizione di stress stabile alle singole celle e diminuito variazione di stato cellulare durante la coltura chemostat (stato stazionario) sono altri benefici di ALE rispetto alle tecniche di coltura a base di batch. ALE indotta da stress di Escherichia coli sottoposti a condizioni succinato alto è introdotto in questo articolo.

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Figura 1: Metodi di evoluzione adattativa di laboratorio (A) chemostat;. (B) trasferimento seriale; (C) trasferimento colonia. Le figure principali illustrare il concetto di metodi per ALE, e le figure in basso mostrano il numero di cellule che sono cresciuti durante ALE. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparazione dell'apparecchiatura

1. Ottenere un barattolo chemostat (150-250 ml) o una beuta (250 ml) contenente una luce di ingresso ed una luce di uscita. Collegare le porte con tubo in silicone che consente portate di 10-100 ml / h. Facoltativamente, utilizzare una presa d'aria, una porta di uscita dell'aria, e le porte di ingresso e uscita a temperatura controllata.
2. Ottenere un dispositivo adatto per il barattolo chemostat che prevede l'agitazione e la temperatura di controllo (o utilizzare un incubatore agitazione rotante).
3. Ottenere due pompe peristaltiche per erogare mezzo fresco e raccogliere la cultura.
4. Ottenere un vaso serbatoio (10-20 L) contenente una porta di uscita media e una porta di ingresso dell'aria.
5. Ottenere tubo in silicone adatto per il tasso di diluizione (ad esempio, ID 0,8 mm campo di portata 0,06-36 ml / min; L / S 13 tubi).

2. Preparazione medio e sterilizzazione

1. Media iniziale
   1. Sciogliere 0,3 g di glucosio, 0,08 g NH ₄Cl, 0,05 g di NaCl, 0,75 g di Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, e 0,3 g KH ₂ PO ₄ in 90 ml di acqua distillata (DW) in un vaso chemostato.
   2. Sigillare il vaso chemostat insieme con il tubo con fascette. Non sigillare la presa d'aria.
   3. Sterilizzare il vaso chemostat in autoclave a 121 ° C per 15 min. Dopo la sterilizzazione, conservare il barattolo chemostat a temperatura ambiente.
   4. Sciogliere 0,02 g MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0,01 g CaCl _2, e 0,1 mg di tiamina in 10 ml DW (soluzione A).
   5. soluzione Filter A utilizzando una siringa e un filtro a siringa pre-sterilizzato (un filtro da 0,45 micron pori).
   6. Aggiungere la soluzione A filtra al barattolo chemostat.
2. Lo stress medio
   1. Sciogliere 30 g di glucosio, 8 g di NH ₄ Cl, 5 g di NaCl, 75 g di Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 30 g KH ₂ PO _4, e 300 g di disodio succinato esaidrato (Na ₂ · succinato · 6H <sub> 2 O; il fattore di stress utilizzato in questo esperimento) in 9,9 L DW in un barattolo serbatoio.
   2. Sigillare il vaso serbatoio con il tubo con fascette. Non sigillare la presa d'aria.
   3. Sterilizzare il vaso serbatoio in autoclave a 121 ° C per 15 min. Dopo la sterilizzazione, conservare il vaso a temperatura ambiente.
   4. Sciogliere 2 g MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1 g CaCl _2, e 10 mg di tiamina in 100 ml DW (soluzione A).
   5. Filtro soluzione A con una siringa e un filtro a siringa pre-sterilizzato (un filtro da 0,45 micron pori).
   6. Aggiungere la soluzione A filtra al barattolo serbatoio.
   7. Asetticamente collegare il tubo di silicone sterilizzato al barattolo serbatoio e collegare le pompe peristaltiche.
3. -Stress elevato Media
   1. Preparare il mezzo come nella sezione 2.2, ma con una maggiore concentrazione di stress (cioè, 3-5 g / L elevato nell'adattamento succinato).
      Nota: Questo protocollo è per l'adattamento ad una sollecitazione thin possono essere consegnati attraverso il mezzo. Nel caso di stress fisici quali temperatura, agitazione, o l'illuminazione, la coltivazione dovrebbe essere progettato di conseguenza.

3. La coltivazione iniziale

1. Inoculare una singola colonia di wild-tipo E. coli in una provetta da 15 ml contenente 4 ml di terreno iniziale.
2. Incubare la provetta in un incubatore agitazione per 12 ore a 37 ° C e 220 rpm.
3. Trasferire asetticamente 1 ml di precoltura al barattolo chemostat.
4. Incubare il vaso chemostat, prevedendo aerazione (aria 50 ml / min) e l'agitazione (200 rpm), a 37 ° C per 6 ore.

4. Lo stress Adattamento

1. Asetticamente collegare l'estremità del tubo in silicone dalle pompe al vaso chemostat.
2. Avviare la pompa di scarico (10 ml / h o superiore) e raccogliere la cultura.
   Nota: La coltura deve essere in fase esponenziale, tipicamente 4-8 ore dopo la coltivazione iniziale.
3. Check la densità ottica (600 nm) della cultura dal tubo di uscita.
4. Avviare la pompa di aspirazione (10 ml / h, corrispondente ad un tasso di diluizione 0,1 hr ^-1).
5. Controllare la densità ottica della coltura a 600 nm dalla presa tubo ogni 24 ore.
6. Azionare il chemostat per 96 ore (fatturato 9,6 volte) o più. Se la densità ottica è stabile, scambiare il serbatoio contenente il mezzo high-stress. Se la densità ottica è inferiore a 0.2, fermare la pompa di aspirazione alimentazione per 6 ore. Riavviare la pompa di aspirazione e verificare che la densità ottica è di 0,2.
7. Gradualmente aumentare la concentrazione del fattore stressante cambiando ad un serbatoio contenente una concentrazione di stress elevato.
8. Prelevare campioni della cultura adattato ogni volta che raggiunge un traguardo (ad esempio, un ceppo atto a 100 g / L di stress succinato), e memorizzare per ulteriori analisi genomica.
9. Per la conservazione del campione, mescolare il campione di coltura (0,5 ml) con un sterilizzato 80% glicerolo solution (0,5 ml) e conservarlo a -80 ° C.
   Nota: Se il microrganismo acquisisce la capacità di degradare il fattore di stress durante la procedura ALE, la concentrazione di stress nella giara di fermentazione non è la stessa di quella nel serbatoio fresco.

5. Single-colonia isolamento del ceppo stress-adattato

1. Preparare medio piastra di agar (1,6% agar) contenente lo stesso stress e alla stessa concentrazione del mezzo.
2. Piatto cultura uscita (0,1 ml) dalla chemostat, e incubare a 37 ° C per 16 ore.
3. Raccogliere singole colonie dalla piastra con uno stuzzicadenti sterile e inoculare in provette da 15 ml contenenti la stessa stress e alla stessa concentrazione media come nella chemostato e incubare per 6 ore.
4. Trasferire 1 ml di brodo di coltura in un pallone da 250 ml Erlenmeyer contenente 50 ml di terreno. Harvest 0,5 ml di brodo di coltura ogni 1 ora, e misurare la densità ottica a 600 nm. Confrontare il tasso di crescita del strai adattaton a quella del ceppo selvatico dato il fattore di stress.

Representative Results

Per l'alta-succinato adattamento stress, la wild-type E. coli W3110 ceppo è stato coltivato in un chemostato a D = 0,1 hr ^-1 per 270 giorni (figura 2).

Figura 2: High-succinato sforzo di adattamento di E. coli W3110 con la cultura chemostat. frecce sottili indicano l'ora in cui è stata aumentata la concentrazione di stress, e le frecce in grassetto indicano gli orari in cui sono stati conservati culture. I numeri con frecce indicano le concentrazioni del fattore di stress, sodio succinato esaidrato. La variazione della biomassa durante ALE e le concentrazioni di stress sono rappresentati. Il dato è stato modificato da J. BioSci. Bioeng ^7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Una concentrazione di stress iniziale di 30 g / L (disodio succinato esaidrato) è stata gradualmente aumentata quando la cultura chemostat uno stato di regime, fino alla concentrazione di stress era di 160 g / L. Il E. adattato coli ceppo DST160 (tolleranti a 160 g / L di stress disodico succinato) è stato acquisito dopo 270 giorni. Il ceppo DST160 esposto crescita disinibita sotto stress alta succinato (160 g / l di stress), mentre il ceppo progenitore (W3110) ha mostrato quasi nessuna crescita (figura 3).

Figura 3: curve di crescita del wild-type (W3110, cerchio bianco) e adattato ceppo (DST160, cerchio nero) in condizioni di stress alta succinato La figura mostra che il ceppo adattato cresciuto senza indugio, sotto alta succinato condizioni di stress, mentre allo stato selvatico. tipo non ha fatto. L'errorebarre indicano la deviazione standard di tre esperimenti indipendenti. Il dato è stato modificato da J. BioSci. Bioeng ^7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

I microrganismi sono in grado di adattarsi a quasi tutti gli ambienti a causa del loro rapido tasso di crescita e la diversità genetica. Adaptive evoluzione di laboratorio permette di evolvere microrganismi in condizioni progettati, che fornisce un modo di selezionare gli organismi individuali harboring mutazioni spontanee che sono favorevoli nelle condizioni date.

La tecnica chemostat è più robusto per realizzare evoluzione artificialmente guidato di tecniche di trasferimento per i seguenti motivi: (a) un ambiente stabile - perché tecniche di trasferimento sono basati su colture in lotti sia sul solido o in mezzo liquido, l'ambiente delle cellule varia durante lotto cultura, mentre lo stress ambientale del chemostat è costante; (B) una popolazione più ampia e una selezione continua - la più grande popolazione del chemostat fornisce più la diversità genetica rispetto alla più piccola popolazione di tecniche di trasferimento. selezione continua della chtecnica emostat è un modo più veloce per raggiungere l'evoluzione di selezione intermittente di tecniche di trasferimento. E 'fondamentale che la cultura chemostat non essere contaminato da altri microrganismi durante la procedura di ALE e condizioni asettiche sono tenuti in tutta la cultura chemostat. La procedura ALE può essere modificato da modifiche a fattori di stress, come lo stress ossidativo, stress osmotico, e lo stress prodotto tossico. Ci sono alcune limitazioni tecniche a ALE di cultura chemostat. L'evoluzione avviene per caso; Pertanto, diversi ricercatori possono non essere in grado di ottenere lo stesso risultato evolutivo, anche se le conseguenze delle mutazioni potrebbero essere collegati. Un'altra limitazione è il wash-out della cultura chemostat quando la concentrazione di stress è aumentata troppo velocemente. Se la biomassa viene diminuito per una certa quantità (cioè, OD = 0.2 in questa procedura) dopo la concentrazione di stress è aumentata, la somministrazione del fattore di stress deve essere arrestato per almeno alcune generazioni adare il tempo di adattarsi ceppo.

I recenti sviluppi nella tecnologia di sequenziamento del genoma hanno aiutato la comprensione delle mutazioni che si sviluppano in risposta a determinate condizioni di stress. Ad esempio, una mutazione del DNA altera un particolare effetto sistemico che è vantaggioso per l'ambiente data (cioè tolleranza uno stress tossico). Così, ALE può essere utilizzato per studiare la funzione del gene o regolazione di rete, o come materia prima per 'evoluzione accelerata'. studi ALE sono utili anche nel simulare lo sviluppo di batteri resistenti agli antibiotici, indicando i meccanismi con cui si presentano pericolose farmaco-resistenti ceppi batterici. Come la traiettoria di evoluzione è inciso sul genoma, scoprendo le alterazioni genetiche che portano a fenotipi desiderati (come ad esempio la tolleranza allo stress) è l'ostacolo successivo ceppi volta evoluti si ottengono ^8. Tra le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione attualmente disponibili, la piattaforma Illumina e Ion Torrentforme sono adatti per il rilevamento di sostituzioni nucleotidiche o piccoli indels che si verificano nei ceppi evoluti, ed entrambi sono accessibili. Poiché rilevamento variante solito comporta mappatura breve lettura delle sequenze di riferimento, la disponibilità della sequenza del genoma del ceppo ancestrale è cruciale. Anche se la sequenza del genoma del ceppo fondatore è disponibile da database pubblici, è spesso desiderabile sequenziare simultaneamente con l'evoluta uno, perché ci potrebbero essere delle differenze aggiuntive nel ceppo reale di partenza. I protocolli per l'identificazione di mutazione sono facilmente reperibili tramite il web o una ricerca bibliografica ^9,10. Ad esempio, BRESEQ è una pipeline appositamente progettato per l'analisi genomica di microbi in laboratorio si è evoluta con la prossima generazione di dati di sequenziamento ^11. Il confronto dei ceppi evoluti in determinati traguardi (per esempio, in questi dati rappresentativi, wild-type, DST50, DST100, e DST160) in grado di fornire la sequenza del ceppo evolutos e dare comprensione delle conseguenze di un dato fattore di stress. Pertanto, la conoscenza e le applicazioni di esperimenti ALE, insieme con la biologia del sistema e l'individuazione delle variabili di perturbazione sistemici, sono attesi nel prossimo futuro.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-chemostat fermentor	Biotron Inc.	-	manufactured by special order
silicon tubing	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar	Bellco	Media storage bottle	20 L
chemicals	Sigma-Aldrich	-	reagent grade
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reagent
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reagent, ≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%