Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Summary

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Abstract

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Introduction

RNA-bindende Proteine (RBPs) stellen etwa 10% der S. cerevisiae Proteine ^1,2 und etwa 15% von Säugetierproteinen ^3-5. Sie sind in vielen zellulären Prozessen wie mRNA posttranskriptionales Verarbeitung und Regulation, Übersetzung, Ribosomenbiogenese, tRNA-Aminoacylierung und Modifikation, Chromatin-Remodeling beteiligt, und vieles mehr. Eine wichtige Untergruppe von RBPs ist die mRNA-bindende Proteine (mRNPs) ^6,7. Im Zuge der mRNA Reifung, binden verschiedene RBPs das Transkript und vermitteln ihre Kern Verarbeitung, Export aus dem Zellkern, zelluläre Lokalisation, Übersetzung und Abbau ^6-8. Somit bestimmt die unterschiedliche Menge von RBPs auf ein bestimmtes Transkript zu jedem Zeitpunkt verpflichtet, ihre Verarbeitung und letztlich sein Schicksal.

Die Identifizierung von RBPs mit einer mRNA verbunden sind, könnten unser Verständnis der Prozesse zugrunde liegen, ihre Post-Transkriptionsregulation verbessern. Diverse genetischeWurden in mRNA Regulation beteiligten Proteine zu identifizieren (in ^9-11 prüft), mikroskopische, biochemische und bioinformatische Methoden verwendet. Jedoch nur wenige dieser Verfahren ermöglichen die Identifizierung von Proteinen mit einer bestimmten Ziel-mRNA assoziiert. Bemerkenswert ist die Hefe-Drei-Hybrid-System (Y3H), die die mRNA von Interesse als Köder verwendet eine Expressionsbibliothek in Hefezellen zu screenen. Positive Klone werden in der Regel durch eine Wachstumsselektion oder Reporterexpression ^12-14 beobachtet. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die große Anzahl von Proteinen, die in einer zellulären Umgebung und die Fähigkeit, abgetastet werden kann, die Festigkeit des RNA-Protein-Wechselwirkung zu messen. Nachteile sind die relativ große Anzahl an falsch positiven Ergebnissen aufgrund der unspezifischen Bindung, und das hohe Potenzial für falsch negative Ergebnisse darauf zurückzuführen, zum Teil auf Fehlfaltungen des Fusionsproteins Beute oder der Köder-RNA.

Eine Alternative zur genetischen Ansatz ist Affinität purifiKation RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Poly A enthaltenden mRNAs kann durch die Verwendung von Oligo-dT-Säulen isoliert werden, und deren assoziierte Proteine ​​durch Massenspektrometrie detektiert werden. Die RNA-Protein-Wechselwirkung in seinem zellulären Kontext durch Vernetzung erhalten, die Kurzstrecken-kovalente Bindungen macht. Die Verwendung der Oligo – dT – Säule ergibt eine globale Sicht auf die gesamte Proteom , die mit jeder Poly – A-haltige mRNA ^3,5,15 zugeordnet ist. Allerdings bedeutet dies nicht eine Liste von Proteinen bereitzustellen, die mit einer bestimmten mRNA assoziiert sind. Nur sehr wenige Methoden zur Verfügung, eine solche Identifikation zu erreichen. Das Paar Verfahren beinhaltet die Transfektion von Nukleinsäure mit Komplementarität zum Ziel – mRNA ^16,17. Die Nukleinsäure wird auch an ein Peptid gebunden, das in der Nähe des Interaktionsstelle zu RBPs Vernetzung ermöglicht. Nach der Vernetzung kann das RBP-Peptid-Nukleinsäure isoliert und Proteomik-Analyse unterzogen werden. Vor kurzem wurde ein Aptamer-basierte Methodikerfolgreich angewendet ¹⁸ aus Säugerzelllinien extrahiert. Ein RNA-Aptamer mit verbesserter Affinität an Streptavidin wurde auf eine Sequenz von Interesse (AU-rich Element (ARE) in diesem Fall) entwickelt und aufgeschmolzen. Das Aptamer-ARE-RNA wurde an Streptavidin-Kügelchen und gemischt mit Zelllysat angebracht. Proteine, die mit der ARE-Sequenz zugeordnet wurden gereinigt und identifiziert durch Massenspektrometrie (MS). Obwohl dieses Verfahren Verbände detektiert , die außerhalb der zellulären Einstellungen auftreten (dh in vitro), ist es wahrscheinlich in der Zukunft modifiziert werden , um die Aptamere in das Genom einzuführen und somit die Isolierung von Proteinen mit der mRNA , während in der zugeordneten Freigabe Zellmilieu (dh in vivo). In Hefe, wo genetische Manipulationen gut etabliert sind, bietet die schnelle Methode (entwickelt von Prof. Jeff Gerst Labor) eine Ansicht der in vivo – Vereinigungen ^19. RaPID kombiniert die spezifische und starke Bindung des MS2-Hüllprotein (MS2-CP) an die MS2-RNA-Sequenz und der Streptavidin-Bindungsdomäne (SBP) konjugierte Kügelchen an Streptavidin. Dies ermöglicht eine effiziente Reinigung von MS2-markierten mRNAs durch Streptavidinkügelchen. Darüber hinaus wird die Expression von 12 Kopien von MS2-Schleifen können bis zu sechs MS2-CPs bis gleichzeitig an die RNA binden und die Effizienz seiner Isolation zu erhöhen. Dieses Protokoll wurde daher vorgeschlagen, die Identifizierung neuer mRNA-assoziierten Proteinen zu ermöglichen, sobald die eluierten Proben Proteomik-Analyse durch Massenspektrometrie unterzogen werden.

Wir RaPID kürzlich verwendet , um neue Proteine zu identifizieren mit der Hefe assoziiert PMP1 mRNA ^20. PMP1 mRNA wurde zuvor gezeigt , mit der ER – Membran und dessen 3' – untranslatierten Region (UTR) wurde ²¹ in diesem Verband eine wichtige Determinante erwiesen assoziiert. So RBPs die PMP1 3 'UTR binden , sind wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Lokalisierung zu spielen. RaPID gefolgt von Flüssigkeitschromatographeny-Massenspektrometrie / Massenspektrometrie (LC-MS / MS) führte zur Identifizierung vieler neuer Proteine , die mit PMP1 ²⁰ interagieren. Wir berichten hier über ein detailliertes Protokoll der Methodik RaPID bieten, wichtige Kontrollen, die getan werden müssen, und technische Tipps, die Ausbeute und Spezifität verbessern kann.

Protocol

Hinweis: eine Sequenz einfügen, bestehend aus 12 MS2-Bindungsstellen (MS2 Schleifen; MS2L) in den genomischen Locus gewünschten, in der Regel zwischen dem offenen Leserahmen (ORF) und der 3'-UTR. Ein detailliertes Protokoll für diese Integration wird an anderer Stelle 22 vorgesehen. Stellen Sie sicher , die richtige Insertion und Expression durch PCR, Northern – Analyse oder RT-PCR 20,23. Es ist wichtig zu überprüfen, dass die Integration nicht mit der Synthese des 3'-UTR nicht beigetr…

Representative Results

RaPID ermöglicht die Isolierung einer spezifischen Ziel-RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Kritisch für den Erfolg hält die RNA intakt, so viel wie möglich, wodurch eine ausreichende Menge der Proteine ​​zu erhalten. Um die Isolation Effizienz und Qualität der RNA, Northern – Analyse durchgeführt (Abbildung 1A) bestimmen. Die Northern-Analyse hat den Vorteil, unmittelbar auf die Effizienz und die Qualität der raschen Meldung. Somit können die relativen Me…

Discussion

Verschiedene Methoden verwenden , um die Isolierung von spezifischen mRNAs ihre zugehörigen Proteine ^{11,34 35} zu identifizieren. Diese Verfahren gelten in vitro und in vivo – Strategien RNA-Protein – Wechselwirkungen zu untersuchen. In – vitro – Verfahren inkubieren exogen RNA mit Zelllysat transkribiert RBPs zu erfassen und RNP – Komplexe ^36,37 isolieren. Ein wirksames Konzept dieser Art wurde kürzlich vorgestellt, die die Identifizierung neuer Prot…

Materials

Tris	sigma	T1503
SDS	bio-lab	1981232300
DTT	sigma	D9779
Acidic Phenol (pH 4.3)	sigma	P4682
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)	sigma	P1944
Chloroform	bio-lab	3080521
Formaldehyde	Frutarom	5551820
Glycine	sigma	G7126
NP-40	Calbiochem	492016
Heparin	Sigma	H3393
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)	Sigma	P7626
Leupeptin	Sigma	L2884
Aprotinin	Sigma	A1153
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T9003
Pepstatin	Sigma	P5318
DNase I	Promega	M610A
Ribonuclease  Inhibitor	Takara	2313A
Glass Beads	Sartorius	BBI-8541701	0.4-0.6mm diameter
Mini BeadBeater	BioSpec	Mini BeadBeater 16
Guanidinium	Sigma	G4505
Avidin	Sigma	A9275
Streptavidin Beads	GE Healthcare	17-5113-01
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Yeast tRNA	Sigma	R8508
Biotin	Sigma	B4501
Yeast extract	Bacto	288620
peptone	Bacto	211677
Glucose	Sigma	G8270
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS)
0.2 M NaOH
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB)			0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.
Hot phenol lysis buffer			10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS
3 M Sodium Acetate pH 5.2
100% and 70% Ethanol (EtOH)
RNase-free water
RaPID lysis buffer			20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease  Inhibitor.
2x Cross-linking reversal buffer			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
RaPID wash buffer			20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad	161-0449	For detecting proteins in polyacrylamide gels
SD selective medium			1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)	Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)		1:5,000
Anti GFP antibody	Santa Cruz	sc-8334	1:3,000
Anti rabbit IgG-HRP conjugated	SIGMA	A9169	1:10,000