빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리
Summary
RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.
Abstract
RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.
Introduction
RNA 결합 단백질 (RBPs)는 S.의 약 10 %를 차지 cerevisiae의 단백질 2 및 포유 동물 단백질의 약 3 ~ 15 %. 그들은 이러한 mRNA의 전사 후 처리 및 규제, 번역, 리보솜 생물 발생, tRNA의의 aminoacylation 및 수정, 크로 마틴 리모델링, 그리고 더 많은 세포 과정에 연루되어있다. RBPs의 중요한 하위 그룹은 mRNA에 결합 단백질 (mRNPs) 6,7입니다. mRNA의 성숙의 과정에서, 다른 RBPs은 성적 증명서를 결합하여 핵, 세포 현지화, 번역 및 열화 6-8에서 핵 처리, 수출을 중재. 따라서, 어느 시점에서 특정 성적 증명서에 바인딩 RBPs의 고유 한 세트의 처리 및 궁극적으로 운명을 결정합니다.
의 mRNA와 관련된 RBPs의 식별은 크게 자신의 전사 후 조절을 기본 프로세스에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 유전 다양한현미경, 생화학 및 생물 정보학 방법 (9-11 검토) mRNA의 조절에 관여하는 단백질을 식별하는 데 사용되어왔다. 그러나, 이들 방법의 일부는 특정 대상의 mRNA와 관련된 단백질의 식별을 가능하게한다. 참고로 효모 세포에서 발현 라이브러리를 화면에 미끼로 관심의 mRNA를 이용하는 효모 세 하이브리드 시스템 (Y3H)입니다. 양성 클론은 일반적으로 성장 선택 또는 리포터 식 12-14를 통해 관찰된다. 이 방법의 핵심 이점은, 셀룰러 환경과 RNA – 단백질 상호 작용의 강도를 측정 할 수있는 능력으로 스캔 할 수있는 단백질의 큰 수이다. 단점으로 인한 비특이적 결합에 위양성 결과의 상대적으로 큰 수 및 융합 단백질 먹이 또는 미끼 RNA의 미스 폴딩으로 인해 일부 위음성 결과에 대한 높은 가능성을 포함한다.
유전자 접근 방식에 대한 대안은 친 화성 purifi입니다관련 단백질과 RNA의 양이온. 폴리 A를 함유하는 mRNA를 올리고 DT 컬럼을 사용하여 분리 될 수 있고, 그와 관련된 단백질을 질량 분석에 의해 검출된다. RNA의 단백질 상호 작용은 단거리 공유 결합을하게 가교하여 그 세포 문맥에 보존된다. 올리고 DT 컬럼의 사용은 mRNA의 3,5,15를 A-포함 된 폴리와 관련된 전체 프로테옴의 글로벌 뷰를 얻을 수 있습니다. 그러나 이것은 특정의 mRNA와 관련된 단백질의 목록을 제공하지 않는다. 아주 몇몇 방법은 식별을 수행 할 수 있습니다. 한 쌍의 방법은 표적 mRNA의 16, 17에 상보성 핵산의 트랜 스펙 션을 수반한다. 핵산은 또한 상호 작용 부위에 가까운 부근에 가교 RBPs 허용하는 펩티드에 부착된다. 가교 후, RBP-펩티드 핵산을 분리 할 수 있고, 단백질 체학 분석을 실시한. 최근에, 앱타 머가 기반 방법이었다성공적으로 포유류 세포 선 (18)로부터 추출에 적용. 스트렙 타비 딘에 향상된 친 화성을 갖는 RNA 앱 타머 개발하고 (이 경우, AU 부유 요소 (ARE)) 관심의 서열에 융합되었다. 앱타 머는 ARE-RNA는 스트렙 타비 딘 비드에 부착 된 세포 용 해물과 혼합 하였다. ARE 시퀀스와 연관된 단백질을 정제하고, 질량 분석 (MS)에 의해 확인되었다. 이 방법은 셀룰러 설정 (즉, 생체 외) 외부에서 발생하는 연결을 검출되지만, 상기의 mRNA와 관련된 단백질의 분리를 게놈에 앱 타머를 도입함으로써 가능하도록 미래에 수정 될 가능성이있는 반면 셀룰러 환경 (즉, 생체 내). 유전자 조작이 잘 확립되어 효모에서, (교수 제프 Gerst의 실험실에서 개발) 빠른 방법은 생체 협회 (19)의 전망을 제공합니다. 급속한은 (특정과 MS2 코트 단백질의 결합 강한 MS2-을 결합등) 스트렙 타비 딘 – 결합 도메인 (SBP의 MS2의 RNA 서열 CP)는 공액 비드를 스트렙 타비 딘. 이 스트렙 타비 딘 비즈를 통해 MS2 – 태그의 mRNA를 효율적으로 정화 할 수 있습니다. 또한, MS2 루프 12 카피의 발현은 RNA에 동시에 결합 및 분리의 효율을 높이기 위해 여섯 MS2-CP를 최대 허용한다. 이 프로토콜에 따라서 용출 샘플을 질량 분석기에 의해 단백질 체학 분석을 실시한되면 신규 mRNA에 관련된 단백질의 식별 가능하도록 제안 하였다.
우리는 최근에 효모 PMP1의 mRNA (20)와 관련된 새로운 단백질을 식별하기 위해 빠른을 이용했다. PMP1 mRNA의 이전 ER 막과 연관 될 및 3 '번역되지 않은 지역 (UTR)이이 협회 21의 주요 결정 요인 인 것으로 밝혀졌다 줬습니다. 따라서 PMP1 3 'UTR 바인딩 RBPs은 자국어에 중요한 역할을하는 것으로 보인다. 빠른 액체 크로마토 그래프 다음Y 질량 분석 / 질량 분석기 (LC-MS / MS)은 PMP1 (20)와 상호 작용하는 많은 새로운 단백질의 동정 결과. 여기서, 우리는 빠른 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공해야 할 중요한 컨트롤을 수행하고, 수율 및 특이성을 향상시킬 수있다 기술적 인 조언한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다양한 방법 관련 단백질 11,34 (35)를 식별하는 특정의 mRNA의 분리를 사용한다. 이러한 방법은 RNA 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 생체 외 및 생체 전략에 적용됩니다. 체외 방법은 외생 RBPs를 캡처 RNP 단지 (36, 37)을 분리하는 세포 용 해물과 RNA를 전사 품어. 이 유형의 효과적인 방법은 규제 RNA 모티프 (18)에 결합 신규 단백질의 식별 가능하게?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 빠른 프로토콜을 설정하고 필요한 플라스미드를 제공하는 그들의 도움이되는 조언을 교수 제프 Gerst와 보리스 Slobodin 감사합니다. 우리는 또한 LC-MS / MS 분석과 그녀의 도움을 Smoler 단백질 체학 센터에서이 프로토콜 박사 타마 지브을 설정하는 그녀의 도움 박사 Avigail ATIR – 란데 감사합니다. 우리는 YEF3 항체에 대해 교수 TG Kinzy (럿 거스)을 감사드립니다. 이 작품은 Binational 과학 재단에서 보조금 2,011,013에 의해 지원되었다.
Materials
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1 x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
Referências
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3′-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward–one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
