単離されたワーキングラット心臓におけるグルコースおよび脂肪酸酸化の宿泊料金を決意するための方法
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
哺乳類の心臓は、ATPの主要な消費者であり、収縮のためのエネルギー基質の一定の供給を必要とします。驚くことではないが、心筋の代謝の変化は、収縮機能障害および心不全の発症に関連しています。したがって、代謝と収縮の間のリンクを解明する疾患状態における心臓の適応や不適応を支配するメカニズムの一部に光を当てる必要があります。単離された作業ラット心臓調製物は、同時に、リアルタイム、心収縮機能および酸化的代謝経路に基質を提供し、エネルギーのフラックスで、追跡するために使用することができます。現在のプロトコルは、グルコースおよび脂肪酸、心臓の基板を提供する主要なエネルギーのための酸化の速度を定量的に測定するための緩衝剤の調製及び利用において使用される方法の詳細な説明を提供することを目的とします。サンプル分析およびデータ解釈のために使用される方法も議論されています。簡単に言えば、この技術は、ex vivoでの14 C-放射性標識グルコースおよび3 H-放射性標識長鎖脂肪酸の供給に基づいて正常体温晶質灌流を介して心臓の鼓動。14 CO 2及び3 H 2 Oの端副産物基板を提供するこれらのエネルギーの利用に関与する酵素反応は、その後、定量的冠動脈流出物から回収されます。使用される放射性標識基質の比活性の知識によれば、個々の酸化経路におけるグルコースおよび脂肪酸のフラックスを定量することが可能です。単離された心臓の収縮機能は、適切な記録装置と並行して決定され、直接代謝フラックス値に相関させることができます。技術は、前および負荷および虚血、薬物またはcircula後の変更などの様々なストレス条件に応答して、代謝/収縮の関係を研究するために極めて有用ですティン因子、または遺伝子産物の発現の変化を以下。
Introduction
臨床的関連
哺乳類の心臓では、酸化的代謝経路、ATP生成と心仕事1を介して基板のフラックスとの間には強い正の相関があります。過去20年間、心臓の代謝と機能との間の複雑なリンクの調査は心臓代謝の変化は、収縮不全と心臓病2-4の異なるタイプの設定で可能性の病理学的構造の再構築のための原因であることを認識することがつながっています。したがって、ストレス、心臓の代謝リモデリングを支配するメカニズムの理解が心不全5-7の予防または治療のための治療標的の同定につながることが期待されます。 「心臓代謝の評価」に関する米国心臓協会（American Heart Association）からの科学的声明の最近の刊行物はトンのための科学界の関心の高まりを強調します研究8の彼のフィールド。心臓イメージングの技術進歩は今、心形態および機能の迅速かつ正確な評価を可能にしながら、しかし、心臓代謝のin vivoでの研究は限られており、負担のまま：核磁気共鳴（NMR）分光法およびポジトロン放出断層撮影（PET）イメージングはできますエクスビボこの日付.TO 9定常状態での心臓の高エネルギーリン酸代謝及びクレブス回路のアクティビティを追跡するために使用されるが、これらの技術は、高い運用コストによって、および酸化的代謝に様々な基板の寄与を決定することができないことに悩まされています心の準備作業は、酸化的代謝経路7,9に基板の唯一かつユニークな研究に利用可能な技術、同時にかつリアルタイムで、収縮機能とフラックスを表します。以下のプロトコールは、ラットを決定するために使用される試薬の調製および使用のガイドラインを提供することを目的と孤立した作業ラット心臓における基質利用のエス。
分離されたワーキングげっ歯類ハート装置
技術は、ほぼ半世紀の古いですが、孤立した作業ラットの心臓の準備は、心血管研究のための選択の方法のまま。ランゲンドルフ心臓標本と同様に、作業げっ歯類の心臓は神経ホルモン、他の器官、および他の循環要因の交絡影響から独立して心臓パラメータの広い範囲を測定するための比較的簡単で信頼性が高く、安価な方法を提供しています。しかし、ランゲンドルフ灌流心臓とは対照的に、作業の心臓は、近生理学的な心臓の仕事、in vivoの条件に関連するレベルへの酸化代謝フラックスを生成するための前提条件を実行し続けています。この左心房に接続されたカニューレを介して左心室（LV）に潅流緩衝液を提供することによって達成され、LVがいっぱいとの契約としてされ、バッファは、決定された後負荷静水圧に対する大動脈ラインを介して排出されます。もともとニーリーや同僚10によって記述灌流装置の設計は、その後Taegtmeyer、HEMSとクレブス11によって改善されたが、それ以来はほとんど変更されています。元の装置で説明したように、収縮機能は、心拍出量の決意、メスシリンダーよりも多くを使用していないと大動脈と冠状動脈の流れ10,11を測定するためのストップウォッチを介して評価することができます。いくつかのベンダーは現在、完全な作業げっ歯類心臓灌流システムを提供しています。これらの市販の装置はflowprobes、圧力変換器、圧力 – 容積カテーテルと心臓機能データの取得および分析のために必要なすべての機器を用いて取得することができます。ベンダーは、自社の機器を持つ新しいユーザーを理解するために大規模なドキュメントやトレーニングセッションを提供します。また、いくつかの総説論文の作業心臓instrumに詳細プロトコルentationおよびげっ歯類12-15で心機能を測定するためのカテーテルの使用に関する。この理由のため、我々は簡単に潅流装置と記録装置のセットアップを言及します。現在のプロトコルではなく、同時に2つの主要なエネルギーは、正常な心臓で基質を提供し、グルコースの速度と長鎖脂肪酸酸化を測定するために実施することができる方法の説明ですでに利用可能な情報を補完することを目指しています。私たちは、サンプルの回収および処理するための試薬および緩衝液の調製から、データ分析のために、心筋の酸化的代謝の評価のための放射性標識されたエネルギー基質の利用に関わるすべての手順ここで説明します。
法の原則
心筋細胞は、（脂肪酸（主に長鎖脂肪酸）および炭水化物の酸化的リン酸化からの収縮のためのエネルギーの大部分を生成glucoseおよび乳酸）。心は非常に限られた精力的な埋蔵量を有しており、循環から基板を提供するこれらのエネルギーの安定供給に依存しています。解糖経路を介したグルコースの異化は、その後、ミトコンドリア内膜のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体によって脱炭酸さピルビン酸を生成します。アルブミンまたはリポタンパク質トリグリセリドの循環から抽出された長鎖脂肪酸は、第一の細胞質ゾル中のアシル-CoA分子に活性化し、続いてβ酸化経路を入力するカルニチンシャトルを介してミトコンドリアのマトリックスの内部に搬送されます。グルコースおよび脂肪酸の異化作用によって生成されるアセチル-CoA分子は、ミトコンドリア内膜を横切ってプロトン起動力を構築する電子伝達系によって使用される還元当量（NADH及びFADH 2）を生成するクレブス回路を燃料とATP合成酵素の活性を介してATPを生成します。水および二酸化炭素は、端副生成物でありますクレブス回路の内部で起こっている酵素反応。 14 C-及び3 H-放射性標識された基質の供給を単離し作業心臓に（例えば14 C放射標識グルコースおよび3 H放射性標識オレイン酸のような）その結果、14 CO 2及び3 H 2 Oの生成をもたらすであろうことができます定量的冠動脈流出物から回収されます。 14 CO 2の回収は、密封されたチャンバー内に単離された灌流心を保つことによって、それが心を出るときに、すぐに冠動脈流出物を回収することによって行われます。小さな陰イオン交換カラムは、冠状動脈流出物から3 H 2 Oを分離し、回収するために使用されます。処理されたサンプルからの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、そして使用される放射性標識基質の比活性の知識を持って、それを個別におけるグルコースおよび脂肪酸のフラックスを定量することが可能です酸化は16,17の経路。
Protocol
Representative Results
Discussion
前のプロトコルが同時に分離された作業用ラット心臓におけるグルコース酸化および脂肪酸酸化を介して基板のフラックスを定量化する方法を詳しく説明します。測定値は、その後、ベースラインとストレス条件（ワークロードの変化、虚血再灌流、 等 …）の下での基質代謝と心仕事との関係を決定するために記録された心臓機能パラメータに重ね合わせることができます。代謝/収?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
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