Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
O coração dos mamíferos é um grande consumidor de ATP e necessita de um fornecimento constante de substratos de energia para contracção. Não surpreendentemente, alterações do metabolismo do miocárdio têm sido associados ao desenvolvimento de disfunção contráctil e insuficiência cardíaca. Portanto, desvendar a relação entre o metabolismo e contração deve lançar luz sobre alguns dos mecanismos que regem a adaptação cardíaca ou má adaptação em estados de doença. A preparação trabalhar isolado coração de rato pode ser utilizado a seguir, simultaneamente e em tempo real, a função contrátil cardíaca e fluxo de energia fornecendo substratos em vias metabólicas oxidativas. O presente protocolo tem como objectivo proporcionar uma descrição detalhada dos métodos utilizados para a preparação e a utilização de tampões para a medição quantitativa das taxas de oxidação de glucose e ácidos gordos, a principal energia fornecendo substratos do coração. Também são discutidos os métodos utilizados para a análise da amostra e interpretação de dados.Em resumo, a técnica é baseada no fornecimento de 14C-glucose radiomarcada e um ácido gordo de cadeia longa 3 H- radiomarcado a um coração a bater ex vivo através de perfusão de cristalóide normotérmica. 14 CO 2 e 3 H 2 O, derivados finais de as reacções enzimáticas envolvidas na utilização destes substratos de energia fornecendo, são então quantitativamente recuperada a partir do efluente coronário. Com o conhecimento da actividade específica dos substratos radiomarcados utilizados, é então possível quantificar individualmente o fluxo de glicose e de ácido gordo nas vias de oxidação. função contráctil do coração isolado pode ser determinado em paralelo com o aparelho de controlo apropriado e correlacionado directamente com os valores de fluxo metabólico. A técnica é extremamente útil para estudar a relação metabolismo / contracção em resposta a várias condições de estresse, tais como alterações no pré e pós carga e isquemia, uma droga ou um Circulafactor de Ting, ou após a alteração na expressão de um produto génico.
Introduction
Relevância clínica
No coração dos mamíferos, há uma forte correlação positiva entre o fluxo de substratos através de vias metabólicas oxidativas, geração de ATP e um trabalho cardíaco. Ao longo das últimas duas décadas, a investigação da relação entre o metabolismo intrincada e função cardíaca levou a reconhecer que as alterações no metabolismo cardíaco são uma causa para a disfunção contráctil e remodelação estrutural possivelmente patológica na definição de diferentes tipos de doenças cardíacas 2-4. Portanto, espera-se que a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a remodelação metabólica do coração salientou irá levar à identificação de alvos terapêuticos para a prevenção ou tratamento de insuficiência cardíaca 5-7. A recente publicação de uma declaração científica da American Heart Association sobre "Avaliação Cardiac Metabolism", enfatiza o crescente interesse da comunidade científica para tseu campo de pesquisa 8. Mas, enquanto os avanços tecnológicos na imagem cardíaca agora permitir uma avaliação rápida e precisa da morfologia e função cardíaca, o estudo in vivo do metabolismo cardíaco continua a ser limitado e oneroso: espectroscopia e ressonância magnética (NMR) nuclear Positron Emission Tomography de imagem (PET) pode ser usado para seguir cardíaca metabolismo do fosfato de alta energia e atividade do ciclo de Krebs, mas essas técnicas são atormentados por altos custos operacionais e pela sua incapacidade de determinar a contribuição dos vários substratos para o metabolismo oxidativo em condições de estado estacionário 9 .Para esta data, o ex vivo trabalhando preparação do coração representa a técnica única e exclusiva disponível para estudar, simultaneamente e em tempo real, a função contrátil e do fluxo dos substratos utilizados em vias metabólicas oxidativas 7,9. O protocolo seguinte tem como objetivo fornecer orientações na preparação e utilização de reagentes usados para determinar o ratoes de utilização de substratos no coração isolado de rato de trabalho.
O Aparelho coração isolado Rodent Trabalho
Embora a técnica é quase meio século de idade, a preparação de trabalho isolado coração de rato continua a ser um método de escolha para a investigação cardiovascular. Tal como acontece com a preparação de coração de Langendorff, o funcionamento do coração roedor oferece uma maneira relativamente simples, fiável e barato para medir uma vasta gama de parâmetros cardíacos, independentemente dos efeitos de confusão de outros órgãos, e outros factores neuro-hormonais circulantes. Mas, em contraste com o coração de Langendorff-perfundidos, o funcionamento do coração continua a executar o trabalho cardíaco quase fisiológica, um pré-requisito para a geração de fluxo metabólico oxidativo para níveis que são relevantes para condições in vivo. Isto é conseguido através da entrega do tampão de perfusão para o ventrículo esquerdo (VE) através de uma cânula ligada ao átrio esquerdo, e como o LV e contratos enche, otampão é ejectado através da linha aórtica contra uma determinada pressão hidrostática pós-carga. O design do aparelho de perfusão originalmente descrito por Neely e colegas 10 foi posteriormente melhorado por Taegtmeyer, bainhas e Krebs 11, mas mudou muito pouco desde então. Conforme descrito no aparelho original, função contrátil pode ser avaliada através da determinação do débito cardíaco, usando não mais que os cilindros graduados e um cronômetro para medir aórtica e coronariana flui 10,11. Vários fornecedores oferecem agora sistemas completos de perfusão cardíaca de trabalho de roedores. Estes aparelhos disponíveis comercialmente podem ser adquiridos com flowprobes, transdutores de pressão, um cateter de pressão-volume e todo o equipamento necessário para a aquisição de dados e análise funcional cardíaca. Os fornecedores oferecem extensas sessões de documentação e de formação para dar a conhecer o novo usuário com o seu equipamento. Vários artigos de revisão também protocolos detalhes sobre o instrum coração a trabalharentação e sobre a utilização de cateteres para medir a função cardíaca em roedores 12-15. Por esta razão, vamos citar apenas brevemente o set-up do aparelho de perfusão e do equipamento de gravação. O presente protocolo tem a finalidade de complementar a informação já disponível com uma descrição dos métodos que podem ser utilizados para medir, simultaneamente, as taxas de glucose e oxidação de ácidos gordos de cadeia longa, os dois principais substratos energéticos proporcionando, no coração normal. Descrevemos aqui todos os passos envolvidos na a utilização de substratos de energia radiomarcados para o estudo do metabolismo oxidativo do miocárdio, a partir da preparação de reagentes e tampões para a extracção e processamento de amostras, para a análise de dados.
Princípios do Método
Cardiomiócitos gerar a maior parte de sua energia para a contração da fosforilação oxidativa de ácidos graxos (ácidos graxos de cadeia longa principalmente) e carboidratos (GlucosE e lactato). O coração tem muito limitado reservas energéticas e depende de um fornecimento constante desses substratos energéticos prestar a partir da circulação. O catabolismo da glicose através da via glicolítica produz piruvato que é então descarboxilado por o complexo piruvato desidrogenase da membrana mitocondrial interna. ácidos gordos de cadeia longa, extraídos a partir de albumina ou de circulação de lipoproteínas de triglicéridos, são em primeiro lugar activados em moléculas de acil-CoA no citosol e, posteriormente, transportados para dentro da matriz mitocondrial de transporte através da carnitina para entrar na via beta-oxidação. As moléculas de acetil-CoA produzidas pelo catabolismo da glicose e os ácidos gordos de combustível do ciclo de Krebs para gerar os equivalentes redutores (NADH e FADH2) que são usados pela cadeia de transporte de electrões para construir a força motriz protónica através da membrana mitocondrial interna e gerar ATP por meio da actividade da ATP sintase. Água e dióxido de carbono são os subprodutos finais deas reacções enzimáticas que ocorrem dentro do ciclo de Krebs. O fornecimento de 14 C e 3 H- substratos marcados radioactivamente (tais como 14 C-glicose e ácido oleico radiomarcado 3H-radiomarcado) para o coração isolado irá consequentemente levar à produção de 14 CO 2 e H 2 O 3 que pode ser quantitativamente recuperada a partir do efluente coronário. A recolha de 14 CO 2 é levada a cabo mantendo o coração perfundido isolado dentro de uma câmara selada e por imediatamente a recuperar o efluente coronário medida que sai do coração. Uma coluna de permuta aniónica pequena é usado para separar e recuperar 3 H2O a partir do efluente coronário. A radioactividade das amostras processadas é medido com um contador de cintilação líquida, e com o conhecimento da actividade específica dos substratos marcados radioactivamente utilizado, é então possível quantificar individualmente o fluxo de glicose e de ácido gordo nooxidação percursos 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detalhes do protocolo anterior e os métodos para quantificar simultaneamente o fluxo de substrato através da oxidação da glicose e oxidação dos ácidos graxos no coração isolado de rato de trabalho. As medições pode, então, ser sobreposta aos parâmetros funcionais cardíacas gravadas para determinar a relação entre os substratos e metabolismo trabalho cardíaco sob condições basais e de stress (mudança de carga de trabalho, por isquemia-reperfusão, etc …). É também possível avaliar o modo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
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