前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製
Summary
We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.
Abstract
脊髄切片からの電気生理学的記録は、携帯電話からネットワーク特性に問題の広い範囲を調査する価値のある技術であることが証明されています。私たちは、若いマウス（ – P11 P2）の脊髄の実行可能な斜めのスライスを準備する方法を示しています。この準備では、運動ニューロンは脊髄の前根から出てくる彼らの軸索を保持します。これらの軸索の刺激は脊髄内の運動ニューロンのSOMAの、エキサイティングな運動ニューロン担保に侵入バック伝搬する活動電位を誘発します。逆行性活動電位の記録は、他の識別方法を上回る運動ニューロンのアイデンティティを、特徴付けるため、即時の決定的かつエレガントな方法です。また、運動ニューロンの担保を刺激することは、他の運動ニューロンまたはRとして、脊髄内の運動ニューロンの担保対象を励起するためのシンプルで信頼性の高い方法であります細胞をenshaw。このプロトコルでは、我々は前根刺激に起因する、逆行運動ニューロンのSOMAのからの記録だけでなく、レンショウ細胞の興奮を提示します。
Introduction
歴史的に、シャープな電極を用いた運動ニューロンの記録は、例えば、ネコやネズミ1などの大型動物やマウス2で分離された全脊髄のin vivoで行われました。 SOMAの必要なシールのような運動ニューロンへの直接アクセスを呼びかけ1980年代にパッチクランプ記録技術の出現は、視覚的な指導の下で達成されます。したがって、脊髄スライス標本は容易に1990年代初頭3は達成されています。しかし、初期のスライス標本は、多くの場合、前根を刺激することができませんでした。我々の知る限り、唯一の二つの研究は、横断スライスにおける腹側根の成功刺激を報告している、とどれもマウス4,5から得られませんでした。
運動ニューロンプールはその前根を逸脱軸索を保持する – この記事では、新生児マウス（P11 P2）の実行可能な脊髄スライスを達成するための手法を提示します。ベントRALルート刺激は同じ前根から出た運動ニューロンプールのSOMAのに戻し逆行性活動電位をトリガします。また、運動ニューロン担保対象、他の運動ニューロン6-10とレンショウ細胞11-13を励起します 。唯一の運動ニューロンは、前根ダウンその軸索を送っているので、我々は運動ニューロン10を識別physiologicalyするための簡単で確実な方法として、逆行性活動電位の記録を使用します。
運動ニューロンのアイデンティティを確認するために、潜在的に非包括的または誤解を招く電気生理学的および形態学的な規準を使用することに加えて、脊髄運動ニューロン上の最近の研究はまた、面倒で時間のかかる事後染色16に依存していました。このような識別は、通常は記録された細胞のサンプルに対して実行されます。他の特定の戦略は、運動ニューロンの内因性蛍光を発現するマウス系統に依存しています<sup> 17-19。研究はすでにトランスジェニックマウスラインを使用して、必要な場合は、マーカーの発現はまだ変数であるか、しかし、遺伝的にコードされたマーカーを使用すると、若い年齢で難しいかもしれません。また、逆行性活動電位の記録は、セル記録の開始からすべてのマウスに日常的に行うことができます。ネコ、ラットおよびマウスで無傷の脊髄の準備に取り組んで実験者は、確実に1950年の1,2,20,21ため、このような識別技術を使用しています。最適な条件では、記録された運動ニューロンの事実上すべてから逆行性活動電位を誘発することができました。
また、前根刺激は確実に他の運動ニューロン22,23、またはそれらの標的を励起するために使用することができます。レンショウ細胞10,24,25。ここでは、運動ニューロンのSOMAのからの逆行性活動電位記録の形で前根刺激の用途だけでなく、レンショウ細胞の興奮を提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
Oblique slicing of the spinal cord is important since it allows for unilateral stimulation of motoneuron pools and Renshaw cells at a single vertebral segment in a reliable, comprehensive and specific way. Furthermore, it allows for a quick, elegant and non-ambiguous identification of recorded motoneurons. Next, we will highlight the advantages of this technique compared to other slice preparation methods, and then we will stress out the most common pitfalls to avoid while performing this procedu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Marin Manuel and Olivia Goldman-Szwajkajzer for their help in taking the photographs. The authors also thank Arjun Masukar and Tobias Bock for proofreading the manuscript. Financial supports were provided by the Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-01), the NIH-NINDS (R01NS077863), the Thierry Latran Foundation (OHEX Project), the French association for myopathy (grant number 16026) and Target ALS are gratefully acknowledged. Felix Leroy was the recipient of a "Contrat Doctoral" from the Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
Referências
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