Udarbejdelsen af Oblique Spinal Cord Skiver for ventrale Root Stimulation
Summary
Vi viser, hvordan du forbereder skrå skiver af rygmarven hos unge mus. Dette præparat giver mulighed for stimulering af de ventrale rødder.
Abstract
Elektrofysiologiske optagelser fra rygmarv skiver har vist sig at være en værdifuld teknik til at undersøge en lang række spørgsmål, fra cellulær til netværk egenskaber. Vi viser, hvordan du forbereder levedygtige skrå skiver af rygmarven af unge mus (P2 – P11). I dette præparat, de motoriske neuroner bibeholder deres axoner kommer ud fra de ventrale rødder rygmarven. Stimulering af disse axoner fremkalder back-udbreder aktionspotentialer invaderer motoneuron SOMA og spændende at motoriske soeskende inden rygmarven. Optagelse af antidrom aktionspotentialer er en umiddelbar, definitiv og elegant måde at karakterisere motoneuron identitet, som overgår andre identifikationsmærker metoder. Endvidere stimulere motoriske soeskende er en enkel og pålidelig måde at excitere de kollaterale mål for de motoriske neuroner i rygmarven, såsom andre motorneuroner eller Renshaw celler. I denne protokol, præsenterer vi antidrom optagelser fra motoneuron SOMA samt Renshaw celle excitation, som følge af ventrale rod stimulation.
Introduction
Historisk set blev motoriske optagelser ved hjælp af skarpe elektrode udført in vivo på store dyr såsom katte eller rotter 1 eller på en isoleret hele rygmarven i mus 2. Fremkomsten af plasteret-clamp optagelse teknik i 1980'erne, opfordrede til direkte adgang til motoneuron SOMA som forsegling skulle opnås under visuel vejledning. Således har rygmarven skive forberedelse været let opnået siden begyndelsen af 1990'erne 3. Men tidlig skive forberedelse ofte ikke gav mulighed for stimulering af de ventrale rødder. Så vidt vi ved, har kun to studier rapporteret vellykket stimulering af de ventrale rødder i tværgående skiver, og ingen blev opnået fra mus 4,5.
I denne artikel præsenterer vi en teknik til at opnå levedygtige rygmarvs skiver af neonatale mus (P2 – P11), hvori motoneuron pool bevarer sine ventrale rod afgående axoner. Aftrækral rod stimulation udløser antidrom aktionspotentiale tilbage i listen over SOMA af motoneuron poolen kommer ud fra den samme ventrale rod. Det ophidser også målene for motoriske sikkerhedsstillelse, andre motorneuroner 6-10 og Renshaw celler 11-13. Da der kun motoriske neuroner sender deres axoner ned de ventrale rødder, bruger vi registrering af antidrom aktionspotentialer som en enkel og definitiv måde at physiologicaly identificere motoriske neuroner 10.
Ud over at bruge potentielt ikke-inclusive eller vildledende elektrofysiologiske og morfologiske criterions at bekræfte motoneuron identitet, de seneste undersøgelser af rygmarv motorneuroner også påberåbt sig kedelig og tidskrævende post hoc farvninger 16. En sådan identifikation er normalt kun udføres på en prøve af de optagne celler. Andre strategier identifikation afhængige muselinjer, hvor motoriske neuroner udtrykker endogen fluorescens <sup> 17-19. anvende genetisk indkodede markører kan imidlertid være vanskeligt i en ung alder, når markør-ekspression er stadig variabel eller hvis undersøgelsen allerede kræver anvendelse af en transgen mus linje. Alternativt kan antidrom aktionspotentiale optagelser udføres rutinemæssigt på alle mus fra starten af celle optagelse. Eksperimentatorer arbejder på intakte rygmarv præparater i katten, rotter og mus, pålideligt har brugt sådanne identifikation teknikker siden 1950 1,2,20,21. I optimale forhold, var vi i stand til at fremkalde antidrom aktionspotentialer fra stort set alle de optagede motoriske neuroner.
Endvidere kan ventrale rod stimulation anvendes til en pålidelig excitere andre motorneuroner 22,23 eller deres mål. The Renshaw celler 10,24,25. Vi præsenterer her ansøgninger fra den ventrale rod stimulation i form af antidrom aktionspotentiale optagelser fra motoneuron SOMA samt excitation af Renshaw-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skrå udskæring af rygmarven er vigtigt, da det giver mulighed for ensidig stimulering af motoriske pools og Renshaw celler på et enkelt vertebral segment på en pålidelig, omfattende og specifik måde. Desuden giver det mulighed for en hurtig, elegant og ikke-tvetydige identifikation af indspillede motoriske neuroner. Dernæst vil vi fremhæve fordelene ved denne teknik i forhold til andre skive forberedelse metoder, og så vil vi fremhæve de mest almindelige faldgruber at undgå, mens de udfører denne procedure. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Marin Manuel og Olivia Goldman-Szwajkajzer for deres hjælp i at tage billederne. Forfatterne også takke Arjun Masukar og Tobias Bock til korrekturlæsning manuskriptet. Finansielle bærere blev leveret af Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-Blan-1429-1401), NIH-NINDS (R01NS077863), den Thierry Latran Foundation (OHEX Project), den franske forening for myopati ( tilskud nummer 16026) og Target ALS er taknemmeligt anerkendt. Felix Leroy var modtageren af en "Contrat Doctoral" fra Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
Referências
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d’Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O’Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d’Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O’Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower’s tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O’Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
