Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em> Drosophila</em> Larven
Summary
Drosophila en zoogdieren hematopoietische systemen hebben veel gemeenschappelijke kenmerken, waardoor Drosophila een aantrekkelijke genetische model om hematopoiese te bestuderen. Hier laten we dissectie en montage van grote larvale hematopoëtische organen voor immunohistochemie. We beschrijven ook werkwijzen om verschillende larvale hematopoietische compartimenten waaronder circulerende hemocytes sessiele kristalcellen testen.
Abstract
Vele parallellen tussen de Drosophila en zoogdierlijke bloedvormende organen, hoewel niet de Drosophila lymfoïde oorsprong die zoogdieren adaptieve immuniteit karakteriseren. Drosophila en zoogdieren hematopoiese voorkomen in ruimte en tijd verschillende fasen verschillende bloedcellijnen produceren. Beide systemen onderhouden reservoirs van bloedcel voorlopers waarmee uit te breiden of te vervangen volwassen geslachten. Het hematopoietische systeem maakt Drosophila en zoogdieren te reageren op en aan te passen aan immune uitdagingen. Belangrijk is dat de transcriptie regulatoren en signaalwegen dat de productie, het onderhoud, en de functie van het hematopoietische systeem te bedienen zijn geconserveerd uit vliegt naar zoogdieren. Deze overeenkomsten laten Drosophila worden gebruikt om genetisch model hematopoietische ontwikkeling en ziekte.
Hier hebben we detail assays voor het hematopoietische systeem van Drosophila larven te onderzoeken. InVooral schetsen we methoden om bloedcellen nummers en concentratie te meten, visualiseren een specifiek volwassen afkomst in vivo, en het uitvoeren van immunohistochemie op bloedcellen in omloop en in de hematopoietische orgel. Deze testen kunnen veranderingen in genexpressie en cellulaire processen waaronder signalering, overleving, proliferatie en differentiatie zichtbaar en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van vragen met betrekking hematopoiese onderzoeken. Gecombineerd met de genetische hulpmiddelen in Drosophila, kunnen deze assays worden toegepast om het hematopoëtische systeem van gedefinieerde genetische veranderingen te evalueren. Hoewel niet specifiek hier beschreven, kunnen deze bepalingen ook worden gebruikt voor kwantificering van de veranderingen, zoals infectie of voeding, van het hematopoietische systeem te onderzoeken.
Introduction
De complexe mechanismen reguleren van de transcriptiefactoren en signaalroutes die de ontwikkeling van het hematopoietische systeem dat storingen in hematologische ziekten coördineren blijven slecht begrepen. Deze transcriptiefactoren signaalbanen, en hun regulatie, zijn sterk geconserveerd tussen Drosophila en zoogdieren hematopoiese 1-5. Dus de Drosophila hematopoëtische systeem vormt een uitstekende genetisch model om de moleculaire mechanismen die hematopoiese en onderliggende hematologische ziektes bepalen.
Soortgelijke zoogdieren, Drosophila genereren bloedcellen, genaamd hemocytes in ruimte en tijd verschillende fasen van hematopoiese. Traditioneel werd gedacht Drosophila hematopoiese te beperken tot fasen in de embryonale mesoderm en het larvale lymfeklier. Recente studies bewijzen dat hematopoiese komt ook voor in larvale wintereik clusters en in de volwassen buik 6-8. Alle hematopoietische fasen produceren twee soorten volwassen hemocytes: plasmatocytes en kristal cellen. Plasmatocytes zijn macrofaag-achtige cellen betrokken bij fagocytose, aangeboren immuniteit en wondgenezing. Kristalcellen bevatten pro-fenoloxidasen nodig melanisatie, een reactie die in insectencellen immuunresponsen en wondgenezing. Larvale hematopoiese kan een derde volwassen hemocyte soort genereren, een zogenaamde lamellocyte, als reactie op bepaalde immuun uitdagingen, zoals de sluipwesp infectie 9,10. Lamellocytes zijn groot, hechtende cellen die functioneren in samenhang met plasmatocytes en kristal cellen, te integreren en te neutraliseren gelegd in Drosophila larven wesp eieren. Aangezien parasitering worden lamellocytes niet gevonden in wildtype larven. Melanotisch massa's lijken gemelamineerde, ingekapselde wesp eieren; vele Drosophila mutant stammen ontwikkelen melanotisch massa in afwezigheid van parasitering. De aanwezigheid van Lamellocyten en / of melanotisch massa's kan een indicatie van hematopoietische afwijkingen zijn. In feite heeft de melanotisch massa fenotype gebruikt om genen en routes die betrokken zijn bij hematopoiese 11-14 identificeren.
Het larvale hematopoietische systeem is het meest uitgebreid bestudeerd tot nu toe. Het bestaat uit hemocytes circuleert in de hemolymfe, zittend hemocyte clusters gevormd onder de opperhuid en hemocytes die in de lymfeklier. De lymfeklier is een reeks bilaterale lobben aan de dorsale vat. Elke primaire kwab van de lymfeklier is verdeeld in drie belangrijke zones. De buitenste zone staat bekend als de corticale zone en bevat rijpen hemocytes. De binnenste zone wordt het medullaire zone genoemd en bestaat uit zwakke hemocyte precursors. De derde zone, het achterste signalering centrum, is een kleine groep cellen aan de basis van de lymfeklier die fungeren als stamcelachtige niche. Vroeg werk opgericht kritische functies voor Notch 15-18 </sup>, Hedgehog 19,20, JAK-STAT 18 en Vleugelloze 21 activiteit larvale lymfeklier ontwikkeling reguleren. Meer recente studies hebben aangetoond dat 22 BMP, FGF-Ras 23 en Hippo 24.25 signalering ook functioneert binnen de larvale lymfeklier.
Vier larvale hematopoietische assays geschetste beschrijven 1) het meten van circulerende hemocyte concentratie, gedefinieerd als het aantal cellen per volume-eenheid, 2) het isoleren en fixeren circulerende hemocytes voor immunohistochemie, 3) visualiseren crystal cellen in vivo, en 4) het ontleden, het bevestigen en mounting lymfeklieren voor immunohistochemie. Deze testen kunnen worden gebruikt als hematopoietische uitlezingen de functies en voorschriften van signaaltransductiewegen in het larvale hematopoietische systeem te beoordelen. Hoewel deze werkwijzen die eerder in het veld zijn gebruikt, is beelddocumentatie van deze testen pas onlangs begonnen 8,26-30. Verschillende publicaties hier aangehaald zijn hulpful middelen beschrijven gelijkaardige methodes en hematopoietische markers 26,31-33. Bovendien, Trol en Viking zijn nuttige markers van de lymfeklier basaal membraan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij genetische of ecologische verandering kunnen de vier methoden beschreven afzonderlijk of samen worden gebruikt om verschillende processen tijdens hematopoiese zoals signalering, overleving, proliferatie, differentiatie en hematopoëse analyseren Drosophila is een dynamisch proces.; het aantal hemocytes per dier verhoogt 35 de en genexpressie van de lymfeklier 32 verandert tijdens de ontwikkeling. Voorafgaand aan het uitvoeren van deze testen, daarom is het essentieel om eieren verzamel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
Referências
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genética. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genética. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
