genotypering van<em> Staphylococcus aureus</em> Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

Summary

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Abstract

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) is bekend als de voornaamste pathogeen wereldwijd verantwoordelijk voor intramammair infecties (IMI) bij runderen ^1. De studie van Fournier et al. ² aangetoond in Zwitserse koeien en de studies van Cosandey et al. ³ en Boss et al. ⁴ in koeien van de 12 Europese landen die S. aureus geïsoleerd van runderen IMI is een genetisch heterogene groep. Door PCR amplificatie van het 16S-23S rRNA spacergebied intergenische (RS-PCR), werden een totaal van 17 genotypen oorspronkelijk ontdekt in 101 epidemiologisch onafhankelijke isolaten ^2. Genotype B en C genotype (GTC) waren het meest voorkomende (80%), terwijl de andere 15 genotypes (GT), kwam zelden voor, elke maken van 1 tot 4% van alle isolaten. Op Europees niveau ^3, GTB, GTC, GTF, GTI, en GTR waren de belangrijkste genotypen bestaande uit 76% van alle geanalyseerde stammen (n = 456). GTB was gelegen in Midden-Europa WOverwegende dat de andere genotypen werden op grote schaal verspreid. De resterende 24% van de -stammen 41 genotypes, velen werden echter slechts eenmaal waargenomen.

De studies van Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ³ en Graber et al. ⁵ verder aangetoond dat de genotypen sterk geassocieerd met virulentie gen patroon, evenals bij de Zwitserse als op Europees niveau. De studie wees verder uit enorme verschillen in de IMI-prevalentie onder S. aureus GTB, GTC en de andere genotypes ^2,5: overweegt GTB, tot 87% van de koeien in een kudde werden geïnfecteerd door deze genotype. Bij GTC en de andere genotypen echter IMI werd alleen gevonden in 1-2 koeien van een kudde.

IMI veroorzaakt door S. aureus, gewoonlijk leidt tot ontsteking van de overeenkomstige borstklieren en een toename van inflammatoire cellen in melk. Als gevolg daarvan, de somatische cel counts in melk (SCC), de belangrijkste indicator van de kwaliteit van de melk in de meeste landen, wordt verhoogd leidt tot een daling melkprijs of zelfs levering stop.

Naast de RS-PCR van Fournier et al. ^2, zijn andere typen werkwijzen beschreven voor subtypering runderen stammen van S. aureus ^8-11. Twee voorkomende zijn onder andere een spa typen ¹² en Multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. Eerstgenoemde is een basis van DNA sequentiebepaling de variabele spacergebied van Staphylococcus spa gen dat codeert voor proteïne A, terwijl de laatstgenoemde de sequentie van 7 housekeeping genen vereist. Dit betekent dat één en zeven ¹² PCR's ¹³ respectievelijk moeten worden uitgevoerd, gevolgd door amplicon zuivering sequentiereactie en analyse met gebruikmaking van specifieke apparatuur. Vergeleken met RS-PCR, deze methoden vereisen een aanzienlijke extra inspanning in het laboratorium als gevolg een lage monsterdoorvoer en hoge kosten. Dethroughput is bijzonder laag voor PFGE. Gezien de resolutie van deze methoden voor runderen stammen van S. aureus, RS-PCR minstens even goed als spa typen ⁴ en beter dan MLST ⁴ of ¹⁵ PFGE.

Al deze methoden, met inbegrip van binaire typering ¹³ demonstreerden hun effectiviteit bij het verkrijgen van meer inzicht in de pathogenese van runderen IMI veroorzaakt door S. aureus, maar vanwege de genoemde beperkingen zijn ze minder geschikt voor grote klinisch onderzoek. Bovendien, genotypering door RS-PCR zoals beschreven door Fournier et al. ² maakt betrouwbare voorspelling van de epidemiologische en potentieel pathogene S. aureus die betrokken zijn bij runderen IMI, twee belangrijke waarden in de klinische diergeneeskunde.

Protocol

1. Staphylococcus aureus isolaten Verspreid 10 pl S. aureus voorraad cultuur of een kolonie gekweekt op een selectief medium op Columbia agar-platen die 5% schapen bloed (BA). Incubeer aëroob bij 37 ° C gedurende 18 uur tot 24 uur. 2. DNA Extraction Bereid TEL buffer die 10 mM Tris-HCl en 10 mM Na2 EDTA, pH 8,5. Aliquots en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten. Verzamel 1 kolonie van BA met een ste…

Representative Results

Definitie van een genotype en zijn varianten Een elektroforetische profiel verschilt in meer dan één band alle bekende genotypen wordt beschouwd als een nieuw genotype. Nieuwe genotypen worden omschreven en uitgebreid volgens Fournier et al. 5 leidt tot de genotypen GTA te GTZ, gevolgd door de genotypes GTAA te GTAZ en GTBA te GTBZ en GTCA te GTCC thans. Variatie in één band als een genotypische variant…

Discussion

De meest kritische fase van de gehele procedure is wanneer er een overmaat van DNA in RS-PCR (> 30 ng zuiver DNA / assay) ^2. In het algemeen is de resolutie van een profiel is optimaal als alle van de toppen beginnen en eindigen bij de baseline. Indien twee pieken te dicht bij elkaar, resolutie onvolledig. Onder deze omstandigheden kan de bioanalyzer software leiden tot ongepaste piek identificatie waardoor handmatige identificatie vereist is.

Alle zichtbaar gescheiden en relev…

Materials

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw =121.14g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5mol/l	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'