genotyping של<em> Staphylococcus aureus</em> על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

Summary

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Abstract

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Introduction

סטפילוקוקוס (S. aureus) ידוע בתור הפתוגן החשוב ביותר בעולם האחראי לזיהום intramammary (תעש) בבקר ^1. מחקרם של פורנייה et al. ² הפגינו פרות השוויצרי לבין מחקרים על ידי Cosandey et al. ³ ו בוס et al. ⁴ בפרות של 12 מדינות אירופה כי ס aureus מבודד שור תעש היא קבוצה הטרוגנית גנטית. על ידי PCR הגברה של אזור spacer 16S-23S rRNA גניים (RS-PCR), סך של 17 גנוטיפים בתחילה התגלו 101 אפידמיולוגיה עצמאית מבודדים ^2. גנוטיפ B ו- C גנוטיפ (GTC) היו הנפוצים ביותר (80%), לעומת 15 גנוטיפים אחרים (GTS) התרחשו לעתים רחוקות, כל מה שהופך 1 עד 4% מכלל הבידודים. ברמה ³ האירופי, GTB, GTC, GTF, GTI, ו GTR היו גנוטיפים החשובים ביותר המהווים 76% מכלל זני ניתח (n = 456). GTB היה ממוקם במרכז אירופה whereas גנוטיפים אחרים הופצו באופן נרחב. 24% הנותרים של הזנים כללו 41 גנוטיפים, רבים מהם, עם זאת, נצפו רק פעם אחת.

המחקרים ידי פורנייה et al. ^2, Cosandey et al. ^3, ו גרבר et al. ⁵ הפגינו עוד כי גנוטיפים היו קשורים מאוד עם דפוס הגנים הארסיים שלהם, כמו גם על שוויצרי ברמה האירופית. המחקרים נוספים חשף הבדלים מסיביים בשכיחות תעש בין ס aureus GTB, GTC ואת גנוטיפים אחרים ^2,5: בהתחשב GTB, עד 87% של פרות בעדר נדבקו גנוטיפ זה. במקרה של GTC ושל גנוטיפים אחרים, לעומת זאת, תעש נמצא רק 1 עד 2 פרות של עדר.

תעש הנגרם על ידי S. aureus, בדרך כלל תוצאות דלקת של בלוטות החלב המקבילות וגידול של תאים דלקתיים בחלב. כתוצאה מכך, שיתוף תא סומטיunts בחלב (SCC), מחוון המפתח של איכות חלב ברוב מדינות העולם, הוא גדל מוביל מחיר חלב ירד או להפסיק בלידה אפילו.

מלבד RS-PCR של פורנייה et al. ^2, שיטות הקלדה אחרות תוארו עבור תת-סוגי זני שור של ס aureus ^8-11. שני נפוצים כוללים הקלדת ספא ¹² ו Multi לוקוס רצף הקלדה (MLST) ^13. האחד לשעבר מבוסס על DNA רצף באזור spacer משתנה של הגן המקודד ספא staphylococcal לחלבון A, ואילו אחד הדרישות המאוחרות רצף של 7 גנים משק. משמעות הדבר היא כי אחד ¹² ושבעה PCRs ^13, בהתאמה, צריכה להתבצע, ואחריו טיהור amplicon, תגובת סידור וניתוח באמצעות ציוד ספציפי. לעומת RS-PCR, השיטות האלה דורשות מאמץ נוסף ניכר במעבדה וכתוצאה מכך תפוקת מדגם נמוכה ומחירים גבוהים. ההתפוקה נמוכה במיוחד עבור PFGE. בהתחשב ברזולוציה של שיטות אלה זני שור של ס aureus, RS-PCR הוא טוב לפחות כמו ספא הקלדת ⁴ וטוב יותר מאשר MLST ⁴ או PFGE ^15.

כל השיטות הללו כוללים הקלדה בינארי ¹³ הפגינו יעילותם בהשגת תובנה נוספת לתוך בפתוגנזה של שור תעש הנגרמת על ידי S. aureus, אבל בגלל המגבלות שהוזכרו הם פחות מתאימים חקירות קליניות גדולות. בנוסף, גנוטיפ ידי RS-PCR כפי שתואר על ידי פורנייה et al. ² מאפשר חיזוי אמין של אפידמיולוגיים והפוטנציאל פתוגניים של ס aureus מעורב שור תעש, שני ערכים מרכזיים ברפואת וטרינרית קלינית.

Protocol

1. Staphylococcus aureus מבודד מורחים 10 μl של ס תרבות מניות aureus או מושבה אחד גדלה על מצע סלקטיבי על צלחות אגרו קולומביה המכילות דם כבשים 5% (BA). דגירה אירובית על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שע…

Representative Results

הגדרה של גנוטיפ גירסאותיה פרופיל electrophoretic הנבדלים יותר להקה אחת מכל גנוטיפים המזוהה נחשב גנוטיפ חדש. גנוטיפים חדשים בשם והאריך פי פורנייה et al. 5 המוביל גנוטיפים GTA כדי GTZ, ואחריו גנוטי…

Discussion

השלב הקריטי ביותר של ההליך כולו הוא כאשר יש עודף של דנ"א RS-PCR (> 30 ng DNA / assay טהור) ^2. באופן כללי, ברזולוציה של פרופיל היא אופטימלית אם כל הפסגות שלה התחלה וסיום על קו הבסיס. אם שתי פסגות הם קרובים מדי זה לזה, ברזולוציה אינה שלמה. בתנאים אלה, תוכנת bioanalyzer עלולה להוביל…

Materials

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw =121.14g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5mol/l	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'