إجراء ميكانيكي بسيط لإنشاء الحوفي نقص الخلايا الجذعية في الفأر
Summary
تنص المادة التالية سهلة وتقنية استنساخه لخلق فعالية نموذج الفأر المستدام للالحوفي نقص الخلايا الجذعية (LSCD). هذا نموذج حيواني مفيد في اختبار ومقارنة فعالية من العلاجات لأمراض الخلايا الجذعية الحوفي.
Abstract
الحوفي نقص الخلايا الجذعية (LSCD) هو حالة من عطل أو فقدان الخلايا الجذعية الظهارية الحوفي، وبعد ذلك يتم استبدال ظهارة القرنية مع الملتحمة. المرضى الذين يعانون من عيوب المتكررة القرنية، الألم والالتهاب، وفقدان الرؤية.
سابقا، وقد وصفت نموذج الفئران من LSCD وبالمقارنة مع اثنين من نماذج أخرى. وكان الهدف هو إنتاج نموذج الفأر ثابت من LSCD أن كلا يحاكي النمط الظاهري في البشر وتستمر لفترة كافية لتجعل من الممكن لدراسة الفيزيولوجيا المرضية المرض وتقييم علاجات جديدة. هنا، يتم وصف هذه التقنية في مزيد من التفاصيل.
وقد تم تصميم أداة الآلية مع لدغ الدورية لإزالة الصدأ حلقات من سطح القرنية أو لتسهيل السرير الظفرة في المرضى. وهو جهاز مناسبة لإنشاء نموذج LSCD المطلوب. وهي متوفرة بسهولة، وسهلة الاستخدام وأداة مع طرف على ما يرام التي تجعلها مناسبة للعمل على عيون صغيرة، كمافي الفئران. تطبيقه يمنع الصدمات النفسية التي لا داعي لها للعين وأنها لا تؤدي إلى إصابات غير المرغوب فيها، في كثير من الأحيان هو الحال مع نماذج إصابة الكيميائية. وعلى عكس مكشطة حادة، فإنه يزيل ظهارة مع الغشاء القاعدي. في هذا البروتوكول، ومتآكل المنطقة الحوفي مرتين، وبعد ذلك تم حلق ظهارة القرنية بأكملها من حوف إلى حوف. لتجنب الإصابة سدى، والحرص على عدم فرشاة سطح القرنية بمجرد إزالة ظهارة بالفعل.
Introduction
مطلوب ظهارة القرنية للحفاظ على وضوح وسلامة القرنية. يتجدد باستمرار طوال الحياة عن طريق الخلايا الجذعية الظهارية المقيمين في واحد حوف منطقة ضيقة عند تقاطع القرنية والملتحمة. هذه الخلايا الجذعية الحوفي تجديد الذات تلعب دورا حاسما في تجديد ظهارة القرنية، سواء بشكل طبيعي وبعد الاصابة. ونضوب جزئي أو كامل من هذه الخلايا الجذعية يؤدي إلى تقرحات القرنية المتكررة، والألم، تندب القرنية واتساع الأوعية الدموية، وظهور الخلايا الكأسية، وإذا تركت دون علاج، والعمى القرنية. وتعرف هذه الحالة باسم الحوفي نقص الخلايا الجذعية (LSCD) ويمكن أن يكون مجهول السبب. وراثي. أو مكتسبة بسبب الإصابات الكيميائية أو الحرارية، وارتداء العدسات اللاصقة على المدى الطويل، والتهاب مزمن 1-6.
البحث عن LSCD يتطلب نماذج حيوانية مناسبة أن يقلد ليس فقط المرض في البشر، ولكن لا يمكن استنساخه ومستدام، مع الأقلجبل إصابة الهياكل القرنية والعين الأخرى. هذا النموذج هو ضروري لتقييم العلاجات وتوضيح آليات المرض على المستوى الجزيئي والخلوي. كما هو موضح قبل 1، مع استخدام لدغ الدورية، يمكن للمرء بسهولة تطوير نموذج الفأر من LSCD الذي يضم مزايا المشار إليها، واستمرت لمدة ثلاثة أشهر على الأقل. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم نموذج الفأر بسيطة، قابلة للتكرار، والمستدام للLSCD.
لدغ الدورية هو أداة قوية التي تزيل بالتساوي الظهارة دون إصابة سدى الأساسي 1. وقد تم استخدامه للحث على تآكل القرنية المركزي 7 و 8 في الدراسات شفاء الجروح. لم تم الإبلاغ عن تقنية المعروض على خلق LSCD في الماوس قبل. سبق عرضه أساليب تجريف ظهارة مع نتيجة ملعقة حادة في أقل موحدة إصابة خاصة في حوف والنمط الظاهري أكثر متغير 1، 9، مع مزيد من استعادة سو طبيعية ظهارة القرنية 1. على عكس مكشطة حادة، ولدغ الدورية يزيل الغشاء القاعدي الظهارية، وكذلك 7 و 8 و 10. طرق ذكرت أخرى لقطع الخلايا الجذعية تنطوي على استخدام المواد الكيميائية، مثل هيدروكسيد الصوديوم، ن heptanol، وكلوريد البنزالكونيوم، والتي لا يمكن أن تحفز الإصابة غير المرغوب فيها للهياكل العين الكامنة، ولكن أيضا قد تؤدي إلى التهابا حادا وعتامة القرنية لاحقة أو الظهارية الحرشفية حؤول 11-15. لا يرتبط لدغ بالتناوب مع هذه المضاعفات الشديدة. إزالة جراحيا ظهارة الحوفي، وحدها أو مع استخدام المواد الكيميائية 10، 11، 16، هو أكثر صعوبة لأداء وليس الخيار الأفضل في الحيوانات مع عيون صغيرة وظهائر الحوفي رقيقة (مثل الفئران). وبالإضافة إلى ذلك، من المستغرب، limbectomy قد لا تزال تترك بعض من ظهارة الحوفي وراء 10.
وهذا الاسلوب هو موضح أدناه، يؤدي إلى LSCD مع اتساع الأوعية الدمويةد conjunctivalization الذي يحاكي عرض LSCD الكامل في المرضى ويستمر لمدة ثلاثة أشهر على الأقل 1. وهي مناسبة لأولئك الذين يهدفون إلى دراسة LSCD أو جرح الفيزيولوجيا المرضية الشفاء، علم المناعة، والعلاجات المحتملة في الفئران. ربما، مع بعض التعديلات، وهذا الإجراء لا يمكن أن يؤديها في الفئران أو الأرانب 10. كما لدغ الدورية يزيل بكفاءة ظهارة، ويمكن استخدامها في أي بحث المتعلقة القرنية الطلائية الكشط / جرح وفي أي معاملة ذات الصلة أو دراسات البيولوجيا الجزيئية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة تقنية استنساخه وبسيطة نسبيا لخلق نموذج الفأر من LSCD. هناك عدة جوانب هامة من هذا الطراز التي تستحق الملاحظة. أولا، نماذج خلافا التي تستخدم المواد الكيميائية 11، 12، وإصابة ينطوي في المقام الأول ظهارة السطحية (والغشاء القاعدي)، مع الحد الأدنى من الض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر روث Zelkha، MS، لمساعدتها السخية في مجال التصوير. وأيد هذا البحث من قبل برنامج السريرية التنمية العلماء جائزة K12EY021475 إلى ME، منح R01 EY024349-01A1 إلى ARD، الأساسية منحة EY01792 من المعهد الوطني للعيون، المعاهد الوطنية للصحة، ومنحة غير المقيد من البحوث للوقاية من العمى. ARD هو حاصل على جائزة التطوير المهني من البحوث للوقاية من العمى.
Materials
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
- Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
- Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
- Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
- He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
- Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
- Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
- Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
- Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
- Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
- Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
- Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
- Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
- McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).
