Summary
다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다.
Abstract
윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)가 고장 나 각막 상피는 결막로 치환 한 후, 윤부 상피 줄기 세포의 상실의 상태이다. 환자는 재발 성 각막 결함, 통증, 염증, 시력의 손실을 겪고 있습니다.
이전 LSCD의 쥐 모델을 설명하고 다른 두 모델에 비교 하였다. 목적은 두 모방 인간 표현형 및 질병의 병태 생리학 연구와 새로운 치료법을 평가하는 것을 가능하게하기에 충분히 긴 지속 LSCD 일관된 마우스 모델을 제조 하였다. 여기서,이 기술은 더 상세하게 설명한다.
회전 버와 전동 도구는 각막 표면의 녹 반지를 제거하거나 환자의 군 날개 침대를 원활하게하기 위해 설계되었습니다. 원하는 LSCD 모델을 만들 수있는 적절한 장치입니다. 그것은으로, 작은 눈에 작업에 적절하게 좋은 팁과 쉽게 사용할 수, 사용하기 쉬운 도구입니다마우스입니다. 그 응용이 눈에 불필요한 외상 방지 종종 화학적 손상 모델의 경우와 같이 그것을 원하지 않는 손상을 초래하지 않는다. 무딘 스크레이퍼 반대로, 상기 기저막과 상피 세포를 제거한다. 이 프로토콜에서, 윤부 영역은 두 번으로 연마 한 후, 전체 각막 윤부 상피에서 윤부를 면도 하였다. 기질 부상을 방지하기 위해주의 상피가 이미 제거 된 후 각막 표면을 브러시하지 않도록주의한다.
Introduction
각막 상피 세포는 각막의 명확성 및 완전성을 유지하기 위해 필요하다. 그것은 지속적으로 각막과 결막의 교차점에서 윤부 - 좁은 영역에 존재하는 상피 줄기 세포에 의해 수명이 다할 때까지 갱신됩니다. 이러한 자기 갱신 윤부 줄기 세포는 모두 일반적으로 부상 한 후, 각막 상피의 재생에 중요한 역할을한다. 이러한 줄기 세포의 일부 또는 전체 고갈 재발 성 각막 미란, 통증, 각막 흉터 및 신생 혈관, 술잔 세포의 모양을 초래할 것이다 치료, 각막 실명을 떠나는 경우. 이 조건은 윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)로 알려져 있고, 특발성 일 수있다; 유전; 나 때문에 화학 물질 또는 열 손상, 장기간 콘택트 렌즈 착용, 만성 염증 1-6에 인수했다.
LSCD에 대한 연구는 적절한 동물 모델을 필요로 그뿐만 아니라 모방 인간의 질병이 있지만 최소한으로 재현 및 지속다른 각막과 안구 구조에 손상 마운트. 이 모델은 치료를 평가하는 분자 및 세포 수준에서 질병의 메커니즘을 명확하게하는 것이 필요하다. 회전 숫돌을 사용하여, 하나 앞에 설명한 바와 같이, 하나의 용이 상기의 이점을 제공하며 3 개월 이상 지속 LSCD의 마우스 모델을 개발할 수있다. 이 연구의 목표는 LSCD의 단순한 재현, 지속 가능한 마우스 모델을 제시하는 것입니다.
회전 버 균등 기본 기질 1 부상없이 상피를 제거하는 편리한 도구입니다. 이는 상처 치유 연구 각막 미란 (7, 8)을 유도하기 위해 사용되어왔다. 마우스에 LSCD를 작성하는 저작물을-제시 기술은 이전에보고되지 않았습니다. 이전보다 복원 오와 함께, 덜 유니폼 부상, 특히 윤부 및 더 많은 변수 표현형 (1), (9)에 무딘 주걱 결과와 상피를 긁어 방법을 소개F 정상 각막 상피 1. 무딘 스크레이퍼 달리 회전 버어도 7, 8, 10 등의 상피 기저막을 제거한다. 줄기 세포를 절단 할 수있는 다른보고 된 방법들은 근본적인 안구 구조에 불필요한 손상을 유도 할뿐만 아니라, 심각한 염증 및 이후 각막 혼탁 또는 원인이 아니라, 수산화 나트륨, N- 헵탄 및 염화 벤잘 코늄 등의 화학 물질의 사용을 포함 상피 편평 상피 화생 11-15. 회전 버 이러한 심각한 합병증과 연관되지 않습니다. 수술 단독으로 또는 화학 물질 10, 11, 16를 사용하여, 윤부 상피를 제거, 수행하는 것이 더 어렵다 작은 눈 (마우스 등) 얇은 각막 윤부 상피 세포와 동물에서 최고의 옵션이 아닙니다. 또한, 놀랍게도, limbectomy는 여전히 10 뒤에 윤부 상피의 일부를 남겨 둘 수 있습니다.
아래 설명 된 기술은 신생 혈관의와 LSCD가 발생합니다환자의 전체 LSCD의 프리젠 테이션을 모방하고 3 개월 이상 1 지속 개발 conjunctivalization. 이 마우스에서 LSCD 또는 상처 치유의 병태 생리, 면역학, 잠재적 인 치료를 연구하는 것을 목표로하는 사람들에게 적합하다. 아마도, 일부 수정과,이 절차는 쥐 또는 토끼 (10)에서 수행 할 수 있습니다. 상기 회전 숫돌을 효율적 상피를 제거으로서, 각막 상피는 마모 / 상처와 관련된 모든 치료 또는 분자 생물학 연구에 관한 모든 연구에 이용 될 수있다.
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Protocol
동물에서 수행 모든 절차는 비전 연구에서 동물 사용을위한 비전 및 안과 문 연구 협회을 준수합니다. 6 개월 된 남성 / 여성 C57BL / 6J 야생형 마우스에 열네 4 ~ 사용 하였다 : 열 부상 모델 쥐와 대조군 4 개의 (unwounded 각막을).
1. 동물 준비
- 는 A 100 ㎎ / ㎏의 케타민 복강 내 주사, 5 밀리그램 / kg 자일 라진 혼합물로 마우스를 마취. 마취 효과를 찍은 후, 마취의 깊이를 확인하기 위해 발가락을 꼬집어; 동물은 반응하지 않아야합니다.
- 이전 각막 손상의 유무를 확인하기 위해 실험을 실시하기 전에 슬릿 램프 아래에서 눈을 검사한다.
- 눈 상에 1 % 염산 tetracaine에 방울을 주입. 60 후 - 90 초, 감각의 부재를 확인하기 위해 각막 반사를 테스트합니다. Proparacaine 염산염 0.5 %를 대신 사용할 수있다.
- 하면 각막 감각의 손실이특정 부드럽게 눈과 눈 주위의 머리에 5 % 포비돈 - 요오드 한 방울을 배치합니다. 1 분 후, 드롭 닦아 또는 공구 팁과 간섭 모발을 방지하기 위해 눈 주위의 머리에 확산.
2. 각막 상피를 연마
- 수술 장갑과 가운을 착용 할 것. 멸균 회전 버 멸균 핀셋 : 필요한 도구를 준비합니다. 더 나은 제어를 위해, 구부러진 핀셋을 사용합니다. 절차 동안 멸균 시트에 도구를 놓습니다.
- 절곡 핀셋을 사용하여, 비강 측으로부터 덮개를 잡아 부드럽게 눈 proptosing 의해 눈을 안정화. 너무 많은 압력을 사용하지 마십시오.
- 수술 현미경 배로 멸균 회전 숫돌을 사용 윤부 주변 360 면도. 라운드 당 6 초 - 5의 속도로 윤부 주위에 이동합니다.
주 : 버가 하나의 고정 속도를 가지고있다. 그러나, 기존의 속도로 회전하는 상기 "최종 너트"완전 체결한다. - 회전 버와 윤부하는 윤부에서 전체 각막 상피를 제거합니다. 더 나은 결과를 위해, 원형 방식으로 도구를 이동하고 각막 표면에 다소 평행의 팁의 측면에서 작동하도록 유지. 다시 칫솔질하지 않음으로써 상피 세포가 이미 제거 된 영역을 기질을 손상하지 않도록주의하십시오. 눈에 어떤 압력을 가하지 마십시오. 필요에 따라 브러쉬를 청소합니다.
- 각막에 멸균 인산 완충 생리 식염수 방울을 주입하고 부드럽고 깨끗한 티슈로 모든 분리 된 상피 시트를 닦아.
- 어떤 경우 나머지 상피 면도.
- 수술하는 동안 마우스 꼬리에주의를 기울이십시오.
참고 : 움직임이 발생하면, 마취 깊이가 퇴색하고 추가 주입이 필요합니다. 차 주입 볼륨의 3 분의 2로 한 세 번째는 충분합니다. 마취 약물 치료와 동물을 과다 복용하지 마십시오. - 또 다른 눈에 사용하기 전에 모든 도구를 소독.
3. 확인 완료 상피 제거
- 각막에 1 ㎎ / ㎖ 플루 오레 신 나트륨 한 방울을 적용합니다. 30 초 후 각막을 청소하고 상피 세포의 완전한 제거를 확인하기 위해 코발트 블루 필터를 현미경으로 검사합니다.
참고 : 상피 결손과 각막 영역이 녹색으로 가시화된다.
4. 후 작업 관리
- 가열 담요에 동물을 넣고 복구 아래에있는 동안 (그 새장에, 예를 들면) 안전한 장소에 보관합니다. 의식이있는 사람의 회사에서 의식이없는 동물을 보관하지 마십시오.
- 1 % 에리스로 마이신 안과 연고를 적용합니다. 이것은 또한 눈의 건조를 방지 할 수 있습니다. 응용 프로그램을 일주일 동안 항생제 매일 계속합니다.
- kg 프레 노르 핀 피하 절차 후 다시 12 시간 후 / 0.1 mg을 주입한다. 이틀 동안 두 번 하루에 주사를 계속합니다.
- 마취에서 완전히 회복 될 때까지 45 분 - 30 동물을 관찰한다.
노트: 복부 표면에 호흡 근육의 가벼운 운동은 복구 아래에있는 동안 동물의 건강을 나타냅니다.
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Representative Results
이 기술을 수행 한 후 한 달 이내에, 각막의 100 %가 피상적 인 혈관 신생 개발 (그림 1A합니다. 사진 밝은 필드와 코발트 블루 필터에서 슬릿 램프에 연결된 카메라로 촬영했다). 눈의 18/20 (90 %)에서, 혈관 신생이 전체 각막 표면 (도 1A)을 포함했다. 2/20 (10 %)에서, 혈관 신생 3-4 각막 사분면에서 관찰 되었으나, 여전히 각막 중심에 도달했다.
LSCD의 발전을 확인하려면, 전체 마운트 면역 염색 1을 수행 하였다. 이 단계는 프로토콜의 일부가 아닌 목표와 관심에 따라 변경 될 수 있습니다. 세 가지 변화는 LSCD의 지표로 간주되었다 : 사이토 케라틴 (CK)의 부재 (12), 정상 각막 상피 세포 17, 18에 해당하는 중간 필라멘트; CK8의 외관, 간단한 상피 마커
그들이 전체 마운트 샘플의 각막 부분에 세포 (MUC5AC) 어떤 CK8없는 또는 받침 달린 명시 CK12-성숙한 각막 상피 세포 (17), 각막 표면 -throughout (18)의 특정 마커 있지만, 보통, 손상되지 않은 각막 (그림 1B) . 정상의 눈에 비해, CK12 식 injur 거의 존재하지 Y 모델 각막, 그들은 크게 CK8에 대한 긍정적 인 염색을 표시하고 (그림 1B)를 세포 받침 달린있다. 이러한 관찰은 LSCD의 발전을 나타낸다.
면역 염색 결과를 정량화에 관심이있는 경우, 이미지-J는 별도로 동일한 설정 아래에있는 현미경으로 촬영 한 원본, 변경되지 않은 이미지를 20 면역 염색 밀도를 정량화하기 위해 사용합니다. 요약하면, 전체 마운트 샘플의 각막 부분을 선택하는 지역의 통합 밀도와 면적을 측정하고, 배경 (20)에 대한 보정 밀도를 계산한다. CK8 밀도에 CK12의 비율은 이전에 샘플 (1)의 더 큰 수에 제시 하였다. 컨트롤과 비교하여 감소 된 비율 (정상 각막) 각막 표면의 술잔 세포의 모양 LSCD의 발전을 보여준다.
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그림 1 : 마우스에 LSCD을 만든 후 각막 표현형. 슬릿 램프 검사는 모든 각막 한 달 (0.5 mm A, 스케일 바)에 의해 신생 혈관의 어느 정도를 개발하는 것을 알 수있다. 정상 각막은 모든 각막을 통해 CK12을 표현하고 있지만 CK8 또는 술잔 세포 (MUC5AC)의 결여이다. CK8와 받침 달린 세포가 각막 (200 μm의 B, 스케일 바)에 표시하는 동안 CK12는 LSCD 모델의 부재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서는 LSCD의 마우스 모델을 만들 수있는 재생 가능한 비교적 간단한 기술에 대해 설명합니다. 주목할 가치가이 모델의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 먼저, 화학 11, 12를 사용하는 모델과는 달리, 부상 주로 하부 각막 기질 또는 다른 인공 구조물을 최소화 손상 표면 상피 (및 기저막)를 포함한다. 따라서, 절차가 복잡하고 어려워 윤부 줄기 세포를 대상으로하는 간섭의 결과를 평가할 수있는 양으로 만 한정 염증 및 흉터있다. 리 등의 알에 의해 흥미로운 최근 연구. 수술, 화학 치료법의 다른 조합과 상기 회전 숫돌의 사용을 비교 (10)는 또한 안전하고 토끼 LSCD을 만드는 더 효과적 버어 알았다. 두번째 모델은 적어도 최대 세 달 1 안정적인 것으로 보인다. 이 모델 생성의 사용을 포함회전 버, 마우스 상처 연구를 수행하는 사람들에게뿐만 아니라, 각막 작업 임상의에게 친숙한 악기. 무딘 주걱을 사용을 통해 그 장점은 부상이 더 균일하고 1 재현 할 것입니다.
더 윤부 줄기 세포의 파괴, 윤부 영역 회 처리 하였다. 마우스 눈에 근무 경험을 바탕으로, 두 개 이상의 라운드의 치료는 종종 윤부 혈관을 abrades 출혈이 발생합니다. 경우에, 기술은 다른 동물들에 사용되며,이 단계는 각막 상피의 두께에 따라 수정 될 수있다. 본 연구에서는 0.5 mm 버 팁과 전동 공구를 사용 하였다; 다른 형상 및 크기의 버어 팁도 가능하며 각막 사양에 눈 크기에 따라 대신에 사용될 수있다. 리 등. 10 지속적으로 토끼의 각막과 각막 윤부 상피를 제거하기 적합하도록 2.5 mm 버를보고했다.
최적를 얻으려면결과 윤부 각막 상피는 원형 방식으로 면도하고, 버어의 측면을 사용 하였다. 공구 팁 방해 동물의 머리를 방지하기 위해, 포비돈 - 요오드 드롭 대신 닦아 존재의, 눈 주위의 머리에 확산되었다. 이 천공의 원인이 될 수 도구는, 한 자리에 정적으로 운영되어서는 안된다. 출혈이 발생할 수 있습니다 매우 느린 속도로 윤부를 처리하는 단계; 라운드 당 거의 6 sec의 속도가 C57BL / 6J 마우스의 눈에 적합하다. 이보다 염증과 기질의 혼탁을 유발하므로 다시 닦고 노출 된 기질을 방지하는 것이 중요합니다. 상피 연마하면서 압력이 눈에 적용되지 않아야한다. 절차 후, 각막은 완전한 상피 제거 확인하기 위해 형광 염료로 염색했다. 동물, 복구 중에 안구 건조를 방지하는 것이 중요하다. 제한이 방법은 줄기 세포를 100 % 제거 할 수있다. 또한 다소 운영자 의존과 협력을 제공하는 연습이 필요nsistent 결과.
각막 상피 표현형을 연구 할 때, 전체 마운트 염색이 모델의 결과를 평가하는 가장 좋은 방법입니다. 이 단면에만 각각의 특정 부분에 대한 정보를주고있는 반면 전체 각막 상피는 한번 평가 될 수 있기 때문이다.
이 제어 기술은 다른 동물에서 아마 마우스에 LSCD을 유도하고 있습니다. 그것은 LSCD의 적절한 모델 소설 치료를 연구하고 질병의 병태 생리의 넓은 측면을 발견하기를 제공합니다. 약간의 변형으로, 그것뿐만 아니라 각막 창상 치유, 혈관 및 림프관을 연구에 유용 할 수있다.
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Acknowledgments
저자는 영상에서 그녀의 관대 한 지원, 루스 Zelkha, MS 감사합니다. 이 연구는 ME에 임상 과학자 개발 프로그램 상 K12EY021475에 의해 지원되었다, ARD, 국립 안과 연구소, NIH, 그리고 실명을 방지하기 위해 연구에서 무제한 부여에서 핵심 보조금 EY01792에 R01의 EY024349-01A1을 부여합니다. ARD 연구에서 실명 예방에 대한 경력 개발 상을받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
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