Summary
В следующей статье дается легко воспроизводимый метод для эффективного создания устойчивой модели мыши дефицита лимбальных стволовых клеток (LSCD). Эта модель животных полезна при тестировании и сравнения эффективности лечения заболеваний лимбальных стволовых клеток.
Abstract
Дефицит лимбальных стволовых клеток (LSCD) представляет собой состояние неисправности или потере лимбальных эпителиальных стволовых клеток, после чего эпителий роговицы заменяется конъюнктивы. Пациенты страдают от повторяющихся дефектов роговицы, боль, воспаление и потеря зрения.
Ранее мышиной модели LSCD была описана и по сравнению с двумя другими моделями. Цель состояла в том, чтобы произвести последовательную модель мыши LSCD, что оба имитирует фенотип у человека и длится достаточно долго, чтобы сделать возможным изучение патофизиологии болезни и оценить новые методы лечения. Здесь, метод описан более подробно.
Моторизованные инструмент с вращающимся заусенцев предназначен для удаления ржавчины кольца с роговичной поверхности или сгладить крыловидной кровать у пациентов. Это подходящее устройство для создания желаемой модели LSCD. Это легко доступный, простой в использовании инструмент с тонким наконечником, что делает его подходящим для работы на маленьких глаз, посколькуу мышей. Его применение предотвращает ненужную травмы глаз, и это не приводит к нежелательным травмам, как это часто бывает с моделями химического повреждения. В отличие от тупого скребка, он удаляет эпителий с базальной мембраной. В этом протоколе, лимбальных район был истирается два раза, а затем весь эпителий роговицы была выбрита от лимба до лимба. Во избежание травм стромы, были приняты меры, чтобы не чистить поверхность роговицы после того, как эпителий уже была удалена.
Introduction
Эпителий роговицы требуется для поддержания ясности и целостности роговицы. Он постоянно обновляется на протяжении всей жизни эпителиальными стволовыми клетками, проживающих в лимба-узкой зоне на стыке роговицы и конъюнктивы. Эти самообновляющихся лимбал стволовые клетки играют важную роль в регенерации эпителия роговицы, как правило, и после травмы. Частичное или полное истощение этих стволовых клеток будет приводить к рецидивирующих эрозий роговицы, боль, рубцевания роговицы и неоваскуляризации, появление бокаловидных клеток, и если его не лечить, роговице слепоте. Это состояние известно как дефицит лимбальных стволовых клеток (LSCD) и может быть идиопатической; наследственным; или приобретенные в результате химических или термических повреждений, долгосрочные ношения контактных линз, и хронического воспаления 1-6.
Исследование LSCD требует подходящей животной модели, которая не только подражает болезнь у людей, но является воспроизводимым и устойчивым, с меньшей мере,монтирование вреда другим роговицы и глазного структур. Эта модель необходима для оценки лечения и уточнения механизмов болезни на молекулярном и клеточном уровнях. Как было описано до 1, с использованием вращающегося заусенцев, можно легко разработать модель мыши LSCD , который показывает вышеупомянутые преимущества и сохраняется в течение не менее трех месяцев. Целью данного исследования является представить простой, воспроизводимой и устойчивой модели на мышах LSCD.
Вращающийся заусенцев представляет собой удобный инструмент , который равномерно удаляет эпителий , не повредив основную строму 1. Он был использован для индукции центрального участка роговицы эрозии 7, 8 в заживлении ран исследований. Методика настоящим представил создать LSCD в мыши не сообщалось ранее. Ранее введены методы соскоба эпителия с тупым результате шпателем в менее равномерном травмы, особенно у лимба-и более переменной фенотипу 1, 9, с большим восстановление Oе нормальный эпителий роговицы 1. В отличие от тупого скребка, вращающаяся заусенцев удаляет эпителиальный базальную мембрану а также 7, 8, 10. Другие сообщения методы разрывать стволовых клеток включают в себя использование химических веществ, таких как гидроксид натрия, н-гептанол, и хлорид бензалкония, который не только может вызвать нежелательное повреждение к нижележащим структур глаза, но и может привести к значительным воспалением и последующим роговичного помутнения или эпителиальной плоскоклеточной метаплазии 11-15. Вращающийся заусенцев не связано с этими серьезными осложнениями. Хирургически удаления лимбальную эпителий, в одиночку или с использованием химических веществ 10, 11, 16, является более трудным для выполнения и не самый лучший вариант у животных с маленькими глазами и тонким лимбальных эпителии (например , мышей). Кроме того, как ни удивительно, limbectomy все еще может оставить некоторые лимбальных эпителия позади 10.
Описанные ниже методика приводит к LSCD с неоваскуляризации А.Н.d conjunctivalization, имитирующее представление полного LSCD у больных и длится в течение по крайней мере трех месяцев 1. Она подходит для тех, кто стремится изучить LSCD или заживлении ран патофизиологии, иммунологии и потенциальных методов лечения у мышей. Возможно, с некоторыми изменениями, эта процедура может быть выполнена у крыс и кроликов 10. По мере того как вращающаяся заусенцев эффективно удаляет эпителий, оно может быть использовано в любых исследований, относящихся к роговичного эпителиального истиранию / ранении и в любых связанных с лечения или исследований по молекулярной биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, выполняемые на животных соответствуют ассоциации по исследованиям в области заявлений зрения и офтальмологии для использования животных в научных исследованиях зрения. использовались Четырнадцать четырех до шести-месячных мышей C57BL 6J типа мужских / женских / диких: десять мышей для модели травмы и четыре, как у контрольных животных (разматывать роговица).
1. Подготовка животных
- Обезболить мышь с внутрибрюшинного введения 100 мг / кг кетамина и в 5 мг / кг ксилазина смеси. После того, как анестезия вступили в силу, зажать палец, чтобы подтвердить глубину анестезии; животное не должно реагировать.
- Осмотрите глаза под щелевой лампой перед проведением экспериментов, чтобы убедиться в отсутствии какой-либо предыдущей травмы роговицы.
- Привить капли 1% тетракаина гидрохлорид на глаз. Через 60 - 90 секунд, проверить рефлекс роговицы, чтобы подтвердить отсутствие ощущения. Пропаракаина гидрохлорид 0,5% могут быть использованы вместо.
- Когда потеря чувствительности роговицынаверняка, аккуратно поместите каплю 5% повидон-йода на глаз и на волосы вокруг глаз. Вытрите капли через 1 мин или распространить его на волосы вокруг глаз, чтобы предотвратить волос от вмешательства в подсказке.
2. абразивные эпителий роговицы
- Носите хирургические перчатки и халат. Подготовьте необходимые инструменты: стерильный вращающийся заусенцев и пару стерильных пинцетов. Для лучшего контроля, используйте погнутые пинцета. Поместите инструменты на стерильную листа во время процедуры.
- Используя изогнутые пинцет, стабилизировать глаз, захватывая крышки из носовой части и аккуратно proptosing глаз. Избегайте использования слишком много давления.
- Под хирургическим микроскопом бриться на 360 ° вокруг лимбальных области дважды с использованием стерильного вращающегося заусенец. Обойдите лимба со скоростью 5 - 6 сек за раунд.
ПРИМЕЧАНИЕ: заусенцев имеет одну фиксированную скорость. Тем не менее, для того, чтобы вращаться с установленной скоростью, "конец гайки" должен быть полностью затянут. - Удалите весь эпителий роговицы от лимба до лимба с вращающимся заусенцев. Для достижения наилучших результатов, переместите инструмент по кругу и удерживать его несколько параллельно поверхности роговицы для работы с боковой стороны его кончика. Будьте осторожны, чтобы не повредить стромы, не повторно чистить те области, где эпителий уже удалена. Не применять какое-либо давление на глаза. Очистите кончик кисти по мере необходимости.
- Закапывание каплю стерильном фосфатно-солевом буферном растворе на роговице и вытереть любые обособленные эпителиальные листы с мягкой чистящей тканью.
- Бритье оставшийся эпителий, если таковой имеется.
- Обратите внимание на хвост мыши во время операции.
Примечание: Если происходит какое-либо движение, глубина анестезии потускнела и требуется дополнительная инъекция. От одной трети до двух третей первичного введенного объема должно быть достаточно. Не передозировка животное с анестезирующего препарата. - Стерилизовать все инструменты, прежде чем использовать их на другом глазу.
3. Подтвердите Полное удаление Эпителиальное
- Нанесите каплю 1 мг / мл флуоресцеина натрия на роговицу. Очистите роговицу через 30 секунд и исследовать его под микроскопом с кобальтовым синим фильтром для проверки полного удаления эпителия.
Примечание: Роговичные участки с дефектами эпителия визуализируются в зеленый цвет.
4. Послеоперационный уход
- Поместите животное на нагревательную одеяло и держать его в надежном месте (например, в клетке) , тогда как при восстановлении. Не держите в бессознательном состоянии животное в компании сознательных.
- Применяют 1% эритромицин глазной мази. Это также поможет избежать глаз сухости. Продолжить приложение, к которому ежедневно антибиотик в течение недели.
- Вводят 0,1 мг / кг подкожно бупренорфин после процедуры и снова через 12 ч. Продолжить инъекции дважды в день в течение двух дней.
- Наблюдайте животное в течение 30 - 45 мин, до полного выздоровления от наркоза.
ЗАМЕТКА: Умеренная движение дыхательных мышц на вентральной поверхности указывает на животных хорошее самочувствие в то время как при восстановлении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В течение месяца после выполнения этой техники, 100% роговиц разработал поверхностный неоваскуляризации (рис 1A. Фотографии были сделаны с помощью камеры , подключенной к щелевой лампе под ярким полем и кобальта синим фильтром). В 18/20 (90%) , глаз, неоваскуляризация участвует вся поверхность роговицы (Фигура 1А). В 2/20 (10%), неоваскуляризации наблюдалось в трех из четырех квадрантах роговицы, но он все еще достиг роговой центра.
Для того, чтобы утвердить развитие LSCD, вся гора иммунное была выполнена 1. Этот шаг не является частью протокола и могут быть изменены в зависимости от целей и интересов. Три вариации рассматривались в качестве показателей LSCD: отсутствие цитокератин (CK) 12, промежуточную нить специфическими для нормальных эпителиальных клеток роговицы 17, 18; Появление CK8, простой эпителий маркер
Нормальный, неповрежденную роговицу экспресс CK12-специфическим маркером зрелых эпителиальных клеток роговицы 17, 18 -throughout роговичной поверхности, но они лишены каких - либо CK8 или бокаловидных клеток (MUC5AC) на роговичной части целых образцов монтирования (рис 1B) , По сравнению с нормальными глазами, выражение CK12 практически отсутствует на injur у модели роговица, в то время как они значительно показывают положительное окрашивание для CK8 и бокаловидных клеток (Фигура 1В). Эти наблюдения указывают на развитие LSCD.
Если Вы заинтересованы в количественной оценке результатов Иммуноокрашивание, используйте изображения-J отдельно количественно оценить 20 Иммуноокрашивание плотности на оригинальных, неизмененными снимков , сделанных с помощью микроскопа при тех же условиях. Если коротко, то выберите роговой часть всей выборки горы, измерения интегральной плотности и площади для этого региона, а также рассчитать скорректированную плотность для фона 20. Отношение CK12 к плотности CK8 ранее были представлены на большем количестве проб 1. Пониженное соотношение по сравнению с контрольной группой (нормальные роговица) и появление бокаловидных клеток на поверхности роговицы, демонстрируют развитие LSCD.
658 / 54658fig1.jpg "/>
Рисунок 1: роговичный Фенотип После создания LSCD у мышей. Лампа щелевая экспертиза показывает , что все роговица развивать некоторую степень неоваскуляризации на один месяц (A, шкала бар: 0,5 мм). Нормальная роговица выражает CK12 по всей роговице, но лишена какого-либо CK8 или бокаловидных клеток (MUC5AC). CK12 отсутствует в модели LSCD, в то время как CK8 и бокаловидные клетки появляются на роговице (B, масштаб бар: 200 мкм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной статье описывается воспроизводимой и относительно простой метод, чтобы создать модель мыши LSCD. Есть несколько важных аспектов этой модели, которые стоит отметить. Во- первых, в отличие от моделей , которые используют химические вещества , 11, 12, травма в первую очередь включает в себя поверхностный эпителий (и базальную мембрану), с минимальным повреждением основной стромы роговицы или других внутриглазных структур. Таким образом, существует лишь ограниченное воспаление и рубцевание, оба из которых могут усложнить процедуру и сделать его более трудно оценить результаты каких-либо мер, направленных на лимбальных стволовых клеток. Интересно недавнее исследование Ли и др. 10, который сравнивает использование вращающегося заусенцев с различными комбинациями хирургических и химических обработок, также обнаружили заусенец , чтобы быть более безопасными и более эффективными в создании LSCD у кроликов. Во- вторых, эта модель , кажется, стабилен в течение , по крайней мере до трех месяцев 1. Создание этой модели включает в себя использованиевращающийся заусенцев, инструмент, который знаком для врачей, которые работают с роговицей, а также для тех, кто делает исследования мыши ранив. Его преимущество по сравнению с использованием тупой шпатель , что травма является более равномерным и воспроизводимым 1.
Для того, чтобы лучше уничтожить лимбальных стволовые клетки, то лимбальных область обрабатывали дважды. На основе опыта работы на глазах мыши, лечение более двух раундов часто истирает лимбальных кровеносные сосуды и вызывает кровотечение. В том случае, метод используется в других животных, этот шаг может быть изменен в зависимости от толщины роговичного эпителиального. В данном исследовании была использована моторизованный инструмент с наконечником заусенцев 0,5 мм; заусенцев советы в других форм и размеров, также доступны и могут быть использованы вместо того, чтобы, в зависимости от технических характеристик и роговичных по размеру глаз. Ли и др. 10 сообщили о 2,5-мм заусенцев , чтобы быть пригодным , чтобы последовательно удалить роговой оболочки кроликов и лимбальную эпителий.
Для достижения оптимальных результатоврезультат, лимбе и роговице эпителий выбривали по кругу, и была использована боковая сторона заусенцев. Для того, чтобы предотвратить волос животных от вмешательства кончиком инструмента, повидон-йод падение было распространено на волосы вокруг глаза, вместо того, чтобы быть стерт. Инструмент не должен работать статически в одном месте, так как это может вызвать перфорацию. Лечение лимба в очень медленном темпе может привести к кровотечению; скорость почти 6 сек в раунд подходит для C57BL / 6J глаза мыши. Крайне важно, чтобы избежать повторного чистит голую стромы, так как это будет вызывать больше воспаление и стромы помутнение. Давление не должно быть применено к глазу во время абразивной эпителий. После процедуры роговица окрашивали флуоресцеина красителя, чтобы убедиться в полной эпителиальной удаления. Важно, чтобы предотвратить глаз сухость во время восстановления животного. Ограничения в том, что этот метод не может удалить 100% стволовых клеток. Кроме того, несколько зависит от оператора и требует практики, чтобы дать сотрудничествоnsistent результаты.
При изучении роговичного эпителиального фенотипа, вся гора окрашивание является наилучшим способом для оценки результатов этой модели. Это происходит потому, что она позволяет весь эпителий роговицы, чтобы оценить сразу, в то время как поперечные сечения будут давать только информацию о каждом конкретном участке.
Это управляемый метод может вызвать LSCD у мышей, и, вероятно, и у других животных, а также. Она обеспечивает подходящую модель LSCD для изучения новых методов лечения и открыть для себя более широкие аспекты патофизиологии болезни. С некоторыми изменениями, он может быть полезен при изучении роговицы заживления ран, ангиогенеза и лимфангиогенез, а также.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы благодарят Рут Zelkha, MS, за ее щедрую помощь в визуализации. Это исследование было поддержано Программа развития клинический научный сотрудник премии K12EY021475 М.Е., грант R01 EY024349-01A1 на ARD, основной грант EY01792 из Национального института глаза, NIH, и неограниченный грант от исследований, чтобы предотвратить слепоту. ARD является получателем премии в области развития карьеры от исследований по профилактике слепоты.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
- Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
- Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
- Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
- He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
- Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
- Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
- Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
- Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
- Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
- Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
- Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
- Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
- McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).
