En simpel mekanisk fremgangsmåde til at oprette limbal Stem Cell Mangel i Mus

Summary

Følgende artikel giver en nem, reproducerbar teknik til effektivt at skabe et bæredygtigt musemodel af limbal stamcelle-mangel (LSCD). Denne dyremodel er nyttig til at teste og sammenligne effektiviteten af ​​behandlinger for limbale stamcellelinjer sygdomme.

Abstract

Limbal stamcelle-mangel (LSCD) er en tilstand af fejlfunktion eller tab af limbale epiteliale stamceller, hvorefter hornhindens epitel er erstattet med bindehinde. Patienterne lider af tilbagevendende hornhindedefekter, smerte, inflammation og tab af synet.

Tidligere blev en murin model for LSCD beskrevet og sammenlignet med to andre modeller. Målet var at producere en konsistent musemodel for LSCD at begge efterligner fænotype hos mennesker og varer længe nok til at gøre det muligt at undersøge sygdommens patofysiologi og evaluere nye behandlinger. Her er teknikken beskrevet mere detaljeret.

En motoriseret værktøj med en roterende grat er designet til at fjerne rust ringe fra hornhindens overflade eller til at udjævne pterygium seng i patienter. Det er en egnet anordning til at skabe den ønskede LSCD model. Det er en let tilgængelig, let at bruge værktøj med en fin spids, der gør det egnet til at arbejde på små øjne, somi mus. Dens anvendelse forhindrer unødige trauma for øjet og det resulterer ikke i uønskede skader, som det ofte er tilfældet med kemisk skade modeller. I modsætning til en stump skraber, det fjerner epithelet med basalmembranen. I denne protokol, blev limbale område slibes to gange, og så er hele hornhindens epitel blev barberet fra limbus til limbus. For at undgå stroma skade, blev der draget omsorg for ikke at børste hornhindeoverfladen når epithelet allerede var fjernet.

Introduction

Hornhindens epitel er nødvendig for at opretholde klarhed og integritet af hornhinden. Det er hele tiden fornyes gennem hele livet af de epiteliale stamceller bosiddende i limbus-en smal zone ved krydset af hornhinden og bindehinden. Disse selv-fornyende limbale stamceller spiller en afgørende rolle i at regenerere hornhindeepitelet, både normalt og efter skaden. Delvis eller fuldstændig udtømning af disse stamceller vil resultere i tilbagevendende hornhinde erosioner, smerter, hornhinde ardannelse og neovaskularisering, udseende slimceller, og hvis venstre ubehandlet, hornhinde blindhed. Denne betingelse er kendt som limbal stamcelle-mangel (LSCD) og kan være idiopatisk; arvelig; eller erhvervet som følge af kemiske eller termiske skader, langsigtede kontaktlinser slid, og kronisk inflammation ^1-6.

Forskning i LSCD kræver en passende dyremodel, at ikke kun efterligner sygdom hos mennesker, men er reproducerbar og bæredygtig, med mindst enmount af skade på andre hornhinde og okulære strukturer. Denne model er nødvendigt at vurdere behandlinger, og at klarlægge de sygdomsmekanismer på molekylære og cellulære niveauer. Som beskrevet før ^1, med anvendelse af en roterende Burr, kan man let udvikle en musemodel for LSCD der indeholder de førnævnte fordele og vedvarer i mindst tre måneder. Målet med denne undersøgelse er at præsentere en enkel, reproducerbar, og bæredygtig musemodel af LSCD.

Den roterende Burr er et praktisk værktøj, der jævnt fjerner epitel uden at skade den underliggende stroma ^en. Det er blevet anvendt til at inducere centrale hornhinde erosion ^{7, 8} ved sårheling undersøgelser. Den hermed præsenteret teknik til at skabe LSCD i en mus er ikke blevet rapporteret før. Tidligere indførte fremgangsmåder til skrabning epithelet med en stump spatel resultat i en mindre ensartet skade-især ved limbus-og en mere variabel fænotype ^{1, 9,} med mere restaurering of normal hornhindeepitel ^1. I modsætning til den stumpe skraber, den roterende grat fjerner epitelbasalmembranen samt ^{7, 8, 10.} Andre rapporterede fremgangsmåder til at udsondre stamceller indebærer brug af kemikalier, såsom natriumhydroxid, n-heptanol, og benzalkoniumchlorid, som ikke kun kan inducere uønsket skade på underliggende øjet strukturer, men også kan føre til betydelig inflammation og efterfølgende corneal uigennemsigtighed eller epithelial squamous metaplasi ^11-15. Den roterende burr er ikke forbundet med disse alvorlige komplikationer. Kirurgisk fjernelse af limbale epitel, alene eller med anvendelsen af kemikalier ^{10, 11, 16,} er mere vanskelig at udføre og er ikke den bedste løsning i dyr med små øjne og en tynd limbal epitel (som mus). Desuden overraskende limbectomy kan stadig lade nogle af de limbale epitel bag ^10.

Den nedenfor beskrevne teknik vil resultere i LSCD med neovaskularisering end conjunctivalization der efterligner præsentationen af komplette LSCD hos patienter og varer i mindst tre måneder ^1. Den er velegnet til dem, der har til formål at studere LSCD eller sårheling patofysiologi, immunologi, og potentielle behandlinger i mus. Muligvis, med nogle ændringer, denne procedure kan udføres på rotter eller kaniner ^10. Som det roterende burr effektivt fjerner epithelet, kan det anvendes i en hvilken som helst forskning vedrørende hornhindeepithelets abrasion / sårdannelse og i enhver tilknyttet behandling eller molekylærbiologiske undersøgelser.

Protocol

Alle procedurer udføres på dyrene opfylder Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi erklæringer til dyr brug i synet forskning. Fjorten fire til seks måneder gamle mandlige / kvindelige C57BL / 6J vildtypemus blev anvendt: ti mus for skaden model og fire som kontroldyr (læderet hornhinder). 1. Dyrepræparation Bedøver en mus med en intraperitoneal injektion af en 100 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin-blanding. Efter bedøvelsen har fået virkning, klemmes tå for …

Representative Results

Inden for en måned efter at have udført denne teknik, 100% af hornhinderne udviklede overfladisk neovaskularisering (figur 1A. Billeder blev taget med et kamera forbundet til en spaltelampe under et lyst felt og kobolt blåt filter). I 18/20 (90%) af øjnene, neovaskularisering involverede hele hornhindens overflade (figur 1A). I 2/20 (10%) blev neovaskularisering observeret i tre ud af fire hornhinde kvadranter, men det stadig nået hornhindens centru…

Discussion

Denne artikel beskriver en reproducerbar og forholdsvis simpel teknik til at skabe en musemodel for LSCD. Der er flere vigtige aspekter af denne model, der er værd at bemærke. Først, i modsætning modeller, der bruger kemikalier ^{11, 12,} skaden involverer primært overfladen epitel (og basalmembran), med minimal skade på det underliggende corneale stroma eller andre intraokulære strukturer. Således er der kun begrænset betændelse og ardannelse, som begge kan komplicere proceduren og gøre det vanskelig…

Materials

Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	0.5 mm burr. Also available from other companies.
Surgical microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M691
Digital camera	Nikon, Thailand
Nikon FS-2 slit lamp	Nikon, Japan
Polyclonal anti-CK12 antibody	Santa Cruz Blotechnology, CA,	SC-17101	1:100 concentration
Monoclonal anti-CK8 antibody	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	1:50 concentration