Die arteriovenöse (AV) Loop in einem Kleintiermodell zur Untersuchung Angiogenesis und Vaskularisierte Tissue Engineering

Summary

Wir beschreiben ein mikrochirurgisches Ansatz zur Erzeugung eines arteriovenösen (AV) loop als Modell Vaskularisierung in vivo in einem isolierten und gut charakterisierten Umgebung zur Analyse. Dieses Modell ist nicht nur nützlich für die Untersuchung der Angiogenese, ist aber auch für den Maschinenbau axial vaskularisiert und transplantierbaren Geweben optimal geeignet.

Abstract

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient’s needs.

Introduction

Den meisten Geweben und Organen im menschlichen Körper sind abhängig von einem funktionellen Blutgefäßnetzwerk, das Nährstoffe, tauscht Gase und entfernt Abfallprodukte liefert. Störung dieses Systems verursacht durch lokale oder systemische vaskuläre Probleme können zu einer Vielzahl von schweren Krankheiten führen. Darüber hinaus wird in Forschungsbereichen wie Tissue Engineering oder der regenerativen Medizin, ein funktionelles Blutgefäßnetz innerhalb künstlich erzeugte Gewebe oder transplantierten Organen ist unverzichtbar für eine erfolgreiche klinische Anwendung.

Seit Jahrzehnten Forscher untersuchen wurden die genauen Mechanismen im wachsenden Gefäß beteiligt tieferen Einblick in pathologischen Situationen, um neue therapeutische Interventionen zu finden, gewinnen und eine bessere Prävention von Gefäßerkrankungen bieten. In dem ersten Schritt grundlegende Prozesse wie Zell-Zell – Wechselwirkungen oder der Wirkung von Molekülen auf Zellen des vaskulären Systems werden gewöhnlich durch in vitro 2D- oder 3D suchtenExperimente. Herkömmlichen 2D-Modelle sind einfach durchzuführen, sind gut etabliert und haben stark zu einem besseren Verständnis dieser Verfahren beigetragen. Zum ersten Mal im Jahre 1980 Folkman et al. in vitro Angiogenese Animpfen von kapillaren Endothelzellen auf mit Gelatine beschichteten Platten ¹ angegeben. Man erhielt sofort Weg zur Veröffentlichung einer Vielzahl weiterer Angiogenese 2D Experimenten an Endothelzellen tube formation Assay ^2, Migrationstest ³ und der Co-Kultivierung verschiedener Zelltypen ^4, sowie andere. Diese Tests werden heute noch verwendet und akzeptiert als Standard in vitro – Methoden.

Allerdings ist diese Versuchsaufbau nicht immer geeignet für die Untersuchung von in vivo Zellverhalten , da die meisten Zelltypen eine 3D – Umgebung benötigen relevante physiologische Gewebestrukturen ⁵ zu bilden. Es konnte gezeigt werden, dass die Architektur der 3D-Matrix für die Kapillar morphogenesi entscheidend ists ⁶ und dass zellextrazellulären Matrix (ECM) Wechselwirkungen und 3D – Kulturbedingungen regulieren wichtige Faktoren , die bei der Tumorangiogenese ^7. Die 3D-Matrix bietet komplexe mechanische Eingaben können Effektor-Proteine ​​binden und Gewebe-Skala solute Konzentrationsgradienten herzustellen. Darüber hinaus wird es als notwendig erachtet , um in vivo morphogenetic und Umbau Schritte in komplexen Geweben ⁵ nachzuahmen. In diesen Systemen sowohl Angiogenese und Vaskulogenese untersucht werden. Während der Angiogenese von der Sprießen von Kapillaren beschreibt Blutgefäße bereits existierenden ^8, bezieht sich Vaskulogenese auf die De – novo – Bildung von Blutgefäßen durch Endothelzellen oder deren Vorläufern ^9,10. Die Reifung der Schiffe wird in einem Prozess namens "Arteriogenese" über die Rekrutierung von glatten Muskelzellen ¹¹ beschrieben. Ein typisches angiogenen de – vitro – Modell ist das Sprießen von Endothelzellen aus bestehenden einschichtigens ausgesät als Monoschicht auf Geloberflächen, auf der Oberfläche der Mikrokügelchen in einem Gel eingebettet oder durch den Bau von Endothelzellen Sphäroiden ^12. In vaskulogener Modelle sind einzelne Endothelzellen in einem 3D-Gel eingeschlossen. Sie interagieren mit benachbarten Endothelzellen vaskulären Strukturen und Netzwerke de novo bilden, in der Regel in Kombination mit unterstützenden Zellen ^12.

Aber auch komplexe 3D in vitro Modelle können nicht in vivo nachahmen Einstellungen vollständig die Vielzahl von Zell-Zell und Zell-ECM – Wechselwirkungen ¹³ gegeben. Stoffe mit hoher Aktivität in vitro nicht automatisch die gleichen Effekte in vivo zeigen und umgekehrt ^14. Für eine umfassende Analyse der Vaskularisation verarbeitet es dringend notwendig ist , in vivo – Modelle , die besser simulieren , um die Situation in den Körper zu entwickeln. Eine große Auswahl von in vivo – Angiogenese – Assays sind in der Literatur beschrieben, einschließlich derKüken Chorionallantoismembran Assay (CAM), der Zebrabärbling – Modell, das Hornhaut Angiogenese – Assay wird die dorsale Luftsack Modell, Kammer der Rückenhaut, die subkutanen Tumormodellen ^14. Jedoch sind diese Tests oft mit Einschränkungen verbunden sind , wie eine schnelle morphologische Veränderungen, Probleme bei der Unterscheidung neuer Kapillaren aus schon bestehenden im CAM – Assay oder den begrenzten Raum in der Cornea – Angiogenese – Assay ^15. Weiterhin Nichtsäugetiersystemen verwendet werden (z. B. der Zebrabärbling – Modell ^16), die in der Xenotransplantation ¹⁷ zu Problemen führt. In der subkutanen Tumormodell, mit Ursprung Angiogenese nur vom Tumor selbst nicht analysiert werden kann, da stark das angrenzende Gewebe zu dem Vaskularisierung Prozess beiträgt. Darüber hinaus kann das umgebende Gewebe eine entscheidende Rolle , den Tumor – Mikroumgebung ¹⁸ zu gestalten.

Nicht nur für die Untersuchung der Angiogenese oder Vaskulogenese gibt es eine starke need für eine standardisierte und de – vivo – Modell gut charakterisiert , sondern auch unterschiedliche Vaskularisierung Strategien im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin zu studieren. Heute ist die Erzeugung komplexer künstliche Organe oder Gewebe ist möglich , sowohl in vitro als auch in vivo. 3D Bioprinting bietet eine On-Demand – Herstellungstechnik für ¹⁹ komplexe 3D – funktionellen Wohn Gewebe zu erzeugen. Weiterhin kann Bioreaktoren zum Erzeugen Gewebe ²⁰ oder sogar den eigenen Körper verwendet werden kann , als Bioreaktor ²¹ verwendet werden. Jedoch ist das Haupthindernis für eine erfolgreiche Anwendung von künstlich erzeugten Geweben der Mangel an Vaskularisierung innerhalb der Konstrukte. Unmittelbaren Anschluss an das Gefäßsystem des Host nach der Transplantation ist eine wesentliche Voraussetzung für das Überleben, insbesondere im Fall von großen künstlichen Geweben oder Organen.

Verschiedene in vitro oder in vivo Prävaskularisation Strategien waren Entwickckelt eine funktionelle Mikrovaskulatur in Konstrukten der Implantation ²² vor herzustellen. Die Implantation eines Gerüsts mit in vitro vorgeformten engineered Kapillaren auf die Rückenhaut der Mäuse führte zu einer schnellen Anastomose der Mäuse Vaskulatur innerhalb eines Tages ^23. Im Gegensatz dazu ist ein Sphäroid Kokultur bestehend aus humanen mesenchymalen Stammzellen und menschlichen Nabelschnurvenen – Endothelzellen in einem dreidimensionalen Netzwerk prevascular montiert Zellen entwickelt weiter nach in vivo – Implantation. Allerdings Anastomose mit dem Host – Gefäßen wurde ²⁴ begrenzt. Vor allem in schlecht vaskularisierten Defekte wie nekrotischen oder bestrahlten Bereiche, diese so genannte extrinsische Vaskularisierung – das Einwachsen von Gefäßen aus der Umgebung in das Gerüst – oft nicht. Intrinsic Vaskularisation, auf der anderen Seite ist, auf der Grundlage einer Gefäßachse als Quelle neuer Kapillaren in das Gerüst Sprießen ^25. Mit der axial Vaskularisierung AnsatzKann das technisch hergestellte Gewebe mit seiner Gefäßachse transplantiert werden und an die lokalen Gefäße an der Empfängerstelle verbunden. Unmittelbar nach der Transplantation wird das Gewebe ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen unterstützt, die die Voraussetzungen für eine optimale Integration entsteht.

Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Modellen für in vivo – Angiogenese und in Anerkennung der wachsenden Bedeutung der Untersuchung axial vaskularisierten Gewebe zu erzeugen, entwickelten wir die mikro Ansatz von Erol und Spira weitere ²⁶ eine arteriovenöse (AV) Schleife im Tiermodell zu erzeugen. Die Verwendung einer vollständig geschlossenen Implantationskammer macht dieses Verfahren sehr gut geeignet , um die Blutgefäßbildung unter "kontrollierten", gut charakterisiert in vivo – Bedingungen (Figur 1) zu studieren. Dieses Modell ist nicht nur nützlich für die Untersuchung der Angiogenese, sondern auch optimal für die axiale Vaskularisation von Gerüsten für Gewebe engin geeigneteering Zwecke.

Protocol

The Animal Care Committee der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) und der Regierung von Mittelfranken, Deutschland, genehmigt alle Experimente. Für die Versuche männliche Lewis-Ratten mit einem Körpergewicht von 300-350 g verwendet wurden. 1. Die arteriovenöse Loop-Modell in der Ratte Implantationsverfahren (Figur 2) Zur Anästhesie eine spezielle Kunststoff – Box verwenden , die über ein Rohr mit dem Isofluran Verdampfer und geschlossen mi…

Representative Results

Tissue Engineering Für technische Zwecke Knochengewebe, eine Reihe von verschiedenen Knochenersatzmaterialien wurden in der Kleintier Ratte AV Schleife Modell 27,28,33,34 implantiert. Vaskularisierung könnte perfekt von 3D – Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) (3A) gezeigt werden. Vaskularisierung eines verarbeiteten Rinder spongiösen Knochens (PBCB) Matrix war signifikant höher in der Schleife Gruppe im Vergleich zur Gruppe ohne Va…

Discussion

Seit mehr als einem Jahrzehnt haben wir erfolgreich die arteriovenöse (AV) Schleife für das Tissue Engineering Zwecke und das Studium der Angiogenese in vivo im Kleintiermodell verwendet. Wir konnten zeigen, dass dieses Modell für mikrochirurgisches Engineering verschiedenen Geweben sehr gut geeignet ist, und dass es auch für die Angiogenese oder Antiangiogenese-Studien verwendet werden.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden
E…

Materials

0.9% sodium chloride	Berlin-Chemie AG	34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6	Ethicon	EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910	Ethicon	V392H
6-0 Prolene / polypropylene	Ethicon	8695H
aluminium spray	Pharma Partner Vertriebs-GmbH	1020
antiseptics	BODE Chemie GmbH
Catheter	B Braun Meslungen AG	4251612-02
contrast agent	Flowtech	MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution	Intervet International GmbH
encre de chine intense indian ink	Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin	Bayer AG
eye ointment	Bayer AG
Formalin 4 %	Carl Roth GmbH & Co. KG	P087.4
Heparin	Ratiopharm GmbH
isoflurane	Abbott Laboratories	6055482
Lewis rat, male	Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium	Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N	Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal	Grünenthal GmbH