Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
Das National Institute of Health ImageJ ist ein leistungsfähiges, frei verfügbaren Bildverarbeitungs-Software-Suite. ImageJ hat umfassende Partikelanalyse-Algorithmen, die effektiv genutzt werden kann, verschiedene biologische Partikel zu zählen. Wenn eine große Anzahl von Zellproben zu zählen, stellt der Zählkammer einen Engpass in Bezug auf die Zeit. Ebenso Membranen von Migration / Invasion Assays mit dem ImageJ Plug-Zellzähler, obwohl eine genaue Zählung, ist außerordentlich arbeitsintensiv, subjektiv und berüchtigt für verursachen Schmerzen am Handgelenk. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir zwei Plugins innerhalb ImageJ für die einzige Aufgabe der automatisierten Hämozytometer (oder bekannten Volumen) und Migration / invasion Zellzählung. Beide Plugins verlassen sich auf die Fähigkeit, qualitativ hochwertige Mikroaufnahmen mit minimalen Hintergrund zu erfassen. Sie sind einfach für den schnellen Zählen und Analyse großer Probengrößen mit integrierten Analysetools zu verwenden und optimierte Kalibrierung von Zählungen zu helfen. Durch die Kombination der Kernprinzips von Zellzähler mit einem automatisierten Zählalgorithmus und post-counting Analyse Dies erhöht die Leichtigkeit, mit der Migrationsassays kann ohne Verlust an Genauigkeit bearbeitet werden.
Introduction
In – vitro – Zellzählung ist eine wichtige Grundtechnik in einem weiten Bereich von Gewebekulturexperimenten. Exakt die Anzahl der Zellen in einer Kultur , die Bestimmung ist von wesentlicher Bedeutung für die experimentelle Reproduzierbarkeit und Standardisierung 1,2. Zellzählung kann ein Hämozytometer manuell über als auch unter Verwendung einer Vielzahl von automatisierten Verfahren, jede mit ihren eigenen Vorteilen und Nachteilen 3,4,5 ausgeführt werden. Die meisten der automatisierten Verfahren zur Zellzählung gehören zu einer von zwei Klassen, diejenigen, die das Coulter-Prinzip verwenden oder Durchflusszytometrie. Coulter Zähler nutzen Sie Zellen elektrische Widerstand der Zellzahl und Größe zu bestimmen. Sie sind schnell, präzise und kostengünstiger als Durchflusszytometer. Jedoch werden sie selten für nur Zellzählung aufgrund ihrer beträchtlichen Kosten im Vergleich zu manuellen Zählung 3 verwendet. Durchflusszytometer, auf der anderen Seite, sind teuer, aber sie haben viele Anwendungen, wie beispielsweise Zellzählung, Analyse der Zellen Form, structure und Mess interne Zellmarker 4,5. Maschinen, die eine dieser beiden Prinzipien verwenden, sind von vielen Herstellern erhältlich. Manuelle Zählen ist erschwinglich , aber zeitaufwendig und unterliegt Bias , während die automatisierten Verfahren mit einem Bruchteil der Zeit kommen für die manuelle Zählung erforderlich , aber mit teuren Maschinen 6.
Andere häufige Zellkulturverfahren sind de – vitro – Zellbeweglichkeit Assays, nämlich die Zellmigration und Invasion 7. Migration und Invasion Assays werden üblicherweise zur Untersuchung der Zellbeweglichkeit und Invasivität in Antwort auf eine chemotaktische Reaktion verwendet. Darüber hinaus sind sie häufig zu studieren Embryonalentwicklung, Differenzierung, Entzündungsreaktion, und die Metastasierung von mehreren Zelltypen 7-11 verwendet. Zellen, die durch die poröse Membran aus einem Migrationstest migriert oder eingedrungen kann auf zwei verschiedene Weisen quantifiziert werden. Erstens, indem die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff Anfärben Dissoziation from die Membran und Quantifizierung eines Fluoreszenzleser 12. Eine Einschränkung dieser Methode der Quantifizierung ist , dass keine Aufzeichnung der Membranen zurückgehalten werden kann , und es besteht keine Möglichkeit zur weiteren Analyse 13. Die zweite Quantifizierungsverfahren wird für Zellen migrierten / eingedrungen mit Fluoreszenzfarbstoff oder häufiger fixiert und gefärbt werden, wobei zytologischen Farbstoffe wie Kristallviolett, Toluidinblau oder Hämatoxylin-Farbstoff; dann werden die Zellen manuell mit invertierten Mikroskopbilder dieser Membranen quantifiziert , die eine sehr zeitraubende Aufgabe ist 12,13.
Um die Nachteile der manuellen Zellzählung, zwei zuverlässigen und genauen automatischen Zellzähler für Zellkonzentration und für den Migrationstest überwunden wurden entwickelt. Diese automatisierten Zellzähler Algorithmen wurden für ImageJ als Plugin unter Verwendung von Oracle Java-Computer entwickelt. ImageJ ist ein öffentlicher und weit verbreiteten Bildbearbeitungswerkzeug durch das National Institute of Hea entwickeltlth (NIH) 14,15; Somit erleichtert diese Plugins für ImageJ Schreiben eine einfache Integration in die biologische Gemeinschaft.
Automatisierung der Zellzählung sorgt für einen hohen Durchsatz und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu manuellen Zählung. Obwohl andere verfügbare Software und Plugins verwendet werden kann , die Zellkonzentration durch Bildanalyse 5,16,17, Zellkonzentration Calculator Plugin ist schnell und kann auch behandeln Verdünnungen von Zellen und Behandlungen zu berechnen. Darüber hinaus können alle Ergebnisse und Berechnungen aus diesen beiden Zähler gespeichert und exportiert werden. Die beiden Plugins in diesem Dokument beschrieben sind, für die Verwendung eines Phasenkontrastmikroskop für Live Cell Imaging und großes Sichtfeld (gesamte Membran capture) Bildgebung für Migration Assay-Membranen durch die Verwendung eines Binokular optimiert. Die Plugins sind frei zum Download zur Verfügung mit Installationsanweisungen aus: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte, Fehlerbehebung und Einschränkungen
Das Wesen der automatisierten Rechenverfahren, insbesondere die der Partikelanalyse erfordert die mathematische Fähigkeit, diese Partikel zu definieren. Folglich ist die Genauigkeit der beiden Zellkonzentrationsrechner und Migrationsassay Zähler majorly abhängig von Bildwiedergabetreue, das heißt, wie genau das übernommene Bild das Membranzellprobe oder Migrationstest ähnelt. Es ist daher von größter Bedeutung Mikroskop und zugehö…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
Referências
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