Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
El Instituto Nacional de Salud de ImageJ es una suite de software de libre acceso de gran alcance, el procesamiento de imágenes. ImageJ tiene algoritmos de análisis de partículas integrales que se pueden utilizar con eficacia para contar diversas partículas biológicas. Al contar un gran número de muestras de células, el hemocitómetro presenta un cuello de botella en cuanto a tiempo. Del mismo modo, contando membranas a partir de ensayos de migración / invasión con la célula Contador ImageJ plugin, aunque precisa, es la mano de obra intensiva excepcionalmente, subjetiva, y la mala fama por causar dolor en la muñeca. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado dos plugins dentro de ImageJ con la única tarea de hemocitómetro automático (o volumen conocido) y el recuento de células de migración / invasión. Ambos plugins se basan en la capacidad de adquirir micrografías de alta calidad con el fondo mínimo. Son fáciles de usar y optimizado para el conteo rápido y análisis de muestras de gran tamaño con herramientas de análisis incorporadas para ayudar a la calibración de los recuentos. Al combinar el principio básicos de contador de células con un análisis automatizado algoritmo de recuento y post-conteo, esto aumenta en gran medida la facilidad con la que los ensayos de migración pueden ser procesados sin pérdida de precisión.
Introduction
En el recuento de células in vitro es una importante técnica básica en una amplia gama de experimentos de cultivo de tejidos. Determinar con precisión el número de células en un cultivo es esencial para la reproducibilidad experimental y 1,2 normalización. El recuento de células se puede realizar manualmente usando un hemocitómetro, así como el uso de una variedad de métodos automatizados, cada uno con sus propias ventajas y desventajas 3,4,5. La mayoría de los métodos automatizados para el recuento de células pertenecen a una de dos clases, los que utilizan el principio de Coulter o citometría de flujo. Contador Coulter toman ventaja de las células resistencia eléctrica para determinar el número y tamaño de las células. Ellos son rápidos, precisos y más barato que los citómetros de flujo. Sin embargo, rara vez se utilizan sólo para el recuento de células debido a su costo considerable en comparación con el conteo manual 3. Citómetros de flujo, por otro lado, son caros pero tienen muchas aplicaciones tales como el recuento de células, el análisis de la forma de las células, structure y la célula de medida interna Marcadores de 4,5. Las máquinas que utilizan cualquiera de estos dos principios están disponibles de muchos fabricantes. Conteo manual es asequible, pero consume tiempo y sujeto a un sesgo, mientras que los métodos automatizados vienen con una fracción del tiempo necesario para que el recuento manual, pero el uso de máquinas costosas 6.
Otros procedimientos de cultivo celular común están pt ensayos de motilidad de las células in vitro, a saber, la migración celular y la invasión 7. ensayos de migración y la invasión se utilizan comúnmente para investigar la motilidad celular y la invasión en respuesta a una respuesta quimiotáctica. Además, se utilizan ampliamente para estudiar el desarrollo embrionario, la diferenciación, la respuesta inflamatoria, y la metástasis de múltiples tipos de células 7-11. Las células que han migrado o invadido través de la membrana porosa de un ensayo de migración se pueden cuantificar de dos maneras diferentes. En primer lugar, mediante la tinción de las células con un colorante fluorescente, la disociación from de la membrana, y la cuantificación utilizando un lector fluorescente 12. Una limitación de este método de cuantificación es que ningún registro puede ser retenido de las membranas y no hay posibilidad de un mayor análisis 13. El segundo método de cuantificación es para emigrado / células para ser fijados y teñidos con colorante fluorescente o más comúnmente, con colorantes citológicos como cristal violeta, colorante azul de toluidina o hematoxilina invadió; a continuación, las células se cuantificaron utilizando manualmente las imágenes microscópicas invertidas de estas membranas, que es una tarea que consume mucho tiempo 12,13.
Para superar los inconvenientes de conteo de células manual, se desarrollaron dos contadores de células automatizadas fiables y precisos para la concentración de células y para el ensayo de migración. Estos algoritmos contador de células automatizado fueron desarrollados para ImageJ como un plugin usando lenguaje de programación Java de Oracle. ImageJ es una herramienta de procesamiento de imagen pública y ampliamente usada desarrollado por el Instituto Nacional del ciLTH (NIH) 14,15; por lo tanto, escribir estos plugins para ImageJ facilita una fácil integración en la comunidad biológica.
Automatización de recuento de células garantiza un alto rendimiento y reproducibilidad en comparación con el conteo manual. Aunque otro software y plugins disponibles se pueden utilizar para calcular la concentración de células a través de análisis de imágenes 5,16,17, Cell Concentración Calculadora Plugin es rápido y también puede manejar diluciones de células y tratamientos. Por otra parte, todos los resultados y cálculos de estos dos contadores se pueden guardar y exportar. Los dos plugins descritos en este documento están optimizados para el uso de un microscopio de contraste de fases de imágenes de células vivas y gran campo de visión (toda la captura de membrana) de imágenes para membranas de ensayo de migración a través del uso de un microscopio de disección. Los plugins son de libre acceso para descargar las instrucciones de instalación de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos, solución de problemas y limitaciones
La propia naturaleza de los métodos de cálculo automatizados, específicamente los de análisis de partículas, requiere la capacidad matemática para definir estas partículas. En consecuencia, tanto la exactitud de la calculadora de la concentración de células y el contador de ensayo de migración depende mayormente en la fidelidad de la imagen, es decir, cómo de cerca la imagen capturada se asemeja a la membrana de célula o mue…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
Referências
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