Automatisert Kvantifisering og analyse av Cell Telle prosedyrer ved hjelp ImageJ Plugins

Summary

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Abstract

The National Institute of Healths ImageJ er et kraftig, fritt tilgjengelig bildebehandling suite. ImageJ har omfattende partikkel analyse algoritmer som kan brukes effektivt for å telle ulike biologiske partikler. Ved å telle et stort antall celleprøver, presenterer den hemocytometer en flaskehals med hensyn til tid. Likeledes, teller membraner fra migrasjon / invasjon analyser med ImageJ plugin celleteller, men nøyaktig, er usedvanlig arbeidskrevende, subjektiv, og beryktet for å forårsake håndleddet smerte. For å møte dette behovet, har vi utviklet to plugins innenfor ImageJ for den eneste oppgaven av automatiserte hemocytometer (eller kjent volum) og migrasjon / invasjon celle telling. Begge plugins stole på evnen til å tilegne seg høy kvalitet mikrografer med minimal bakgrunns. De er enkle å bruke og optimalisert for rask telling og analyse av store utvalgsstørrelser med verktøy innebygde analyseverktøy for å hjelpe kalibrering av teller. Ved å kombinere hovedprinsipps av celleteller med en automatisk telling algoritme og post-telling analyse, øker dette i stor grad den letthet med hvilken migrasjons analyser kan bli behandlet uten tap av nøyaktighet.

Introduction

In vitro celle-telling er en viktig grunnleggende teknikk i et bredt spekter av vev kultur eksperimenter. Nøyaktig bestemmelse av antallet celler i en kultur er avgjørende for eksperimentell reproduserbarhet og standardisering ^1,2. Celletelling kan utføres manuelt ved hjelp av en hemocytometer samt bruke en rekke automatiserte metoder, hver med sine egne fordeler og ulemper ^3,4,5. De fleste av de automatiserte metoder for celletelling tilhører en av to klasser, de som bruker Coulter-prinsippet eller strømningscytometri. Coulter counter dra nytte av celler elektrisk motstand for å bestemme celleantallet og størrelse. De er raske, nøyaktige og billigere enn flowcytometere. Imidlertid blir de sjelden brukt for bare celletelling på grunn av sin betydelige kostnader sammenlignet med manuell telling ^3. Flowcytometere, på den annen side, er dyre, men de har mange anvendelser som for eksempel celletelling, analyse av cellene form, structure og måle intern celle markører ^4,5. Maskiner som bruker en av disse to prinsippene er tilgjengelig fra mange produsenter. Manuell telling er rimelig, men tidkrevende og under skjevhet mens automatiserte metoder kommer med en brøkdel av den tiden som er nødvendig for manuell telling, men ved hjelp av dyre maskiner ^6.

Andre vanlige cellekultur prosedyrer er in vitro cellemotilitet analyser, nemlig cellemigrasjon og invasjon ^7. Migrasjon og invasjons analysene blir ofte brukt for å undersøke celle motilitet og invasivitet som reaksjon på et kjemotaktisk respons. I tillegg er de mye brukt til å studere embryonisk utvikling, differensiering, inflammatorisk respons, og metastasering av flere celletyper ^7-11. Celler som har migrert eller invadert gjennom den porøse membran i en migrasjonsanalyse kan kvantifiseres på to forskjellige måter. For det første, ved farging av cellene med et fluorescerende fargestoff, dissosiasjon from membranen, og kvantifisering ved anvendelse av en fluorescerende leser ^12. En begrensning ved denne fremgangsmåten for mengde er at ingen registrering kan holdes tilbake av membranene, og det er ingen mulighet for videre analyse ^13. Den andre kvantifisering metoden for migrert / invaderte celler til å bli faste og farget med fluorescerende fargestoff eller mer vanlig, med cytologiske fargestoffer som krystallfiolett, toluidinblått fargestoff eller hematoxylin; Da cellene er kvantifisert manuelt ved hjelp av inverterte mikroskopiske bilder av disse membranene som er en svært tidkrevende oppgave ^12,13.

For å overvinne ulempene ved manuell celletelling, ble to pålitelige og nøyaktige automatisert celle tellere for cellekonsentrasjon og for migrering analyse utviklet. Disse automatiserte celleteller algoritmer ble utviklet for ImageJ som en plugin bruker Oracles Java programmeringsspråk. ImageJ er et offentlig og allment brukt bildebehandlingsverktøy utviklet av National Institute of HeaLTH (NIH) ^14,15; derfor skriver disse plugins for ImageJ muliggjør enkel integrasjon i det biologiske samfunnet.

Automatisering av celletelling sikrer høy gjennomstrømming og reproduserbarhet i forhold til manuell telling. Selv om andre tilgjengelige software og plugins kan brukes til å beregne cellekonsentrasjonen gjennom bildeanalyse ^5,16,17, Cell Konsentrasjon Kalkulator plugin er rask og kan også håndtere fortynninger av celler og behandlinger. Dessuten kan alle resultater og beregninger fra disse to tellerne lagres og eksporteres. De to plugg som er beskrevet i denne artikkelen er optimalisert for bruken av et fasekontrastmikroskop for levende celle avbildning og stort synsfelt (hel membran capture) avbildning for migrering analyse membraner ved anvendelse av en dissekere omfang. De plugins er fritt tilgjengelig for nedlasting med instruksjoner fra: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

1. sammensatt mikroskop og kamera Setup (Cell Konsentrasjon kalkulator) Øk pære lysstyrken til full med lyset innstillingsknappen, bytt til 4X objektiv, og sikre fase kontrast filtre er valgt. MERK: Enhver omvendt fasekontrastmikroskop for vev kultur med en mørk bakgrunn, for eksempel, PhP fasekontrast, kan benyttes følgende standard mikroskop og kamera prosedyrer. Innenfor mikroskop programvare, angi bildefangstinnstillinger til standardverdier. MERK: Se mikroskopet bruke…

Representative Results

Cell Konsentrasjon Kalkulator Figur 1 viser den totale prosessen med CCC kalibrering og tellbar image oppkjøpet. Figur 1A og 1B viser P-plassen kalibrering bilde og beregning av P-plassen lengde i piksler. CCC bestemmer cellekonsentrasjon i et gitt volum med formelen: <p class="jove…

Discussion

Kritiske Steps, feilsøking og begrensninger

Selve innholdet av automatiserte beregningsmetoder, spesielt de av partikkelanalyse, nødvendiggjør matematisk evne til å definere disse partiklene. Derfor nøyaktigheten av både Cell Konsentrasjon Kalkulator og migrasjon analysen telleren er majorly avhengig av bildegjengivelse, det vil si hvor nært tatt bilde ligner på celleprøve eller migrasjon analysen membran. Det er derfor av største betydning for å følge mikroskop og tilhørende progr…

Materials

HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA  1X PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 – 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides – Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293,
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth – 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2   2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required