Un procédé d'extraction Pigments de Squid<em> Doryteuthis pealeii</em

Summary

Un protocole pour l'extraction de pigments à partir des granulés nanostructurés dans squid Doryteuthis pealeii chromatophores est présenté.

Abstract

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Introduction

Céphalopodes tels que les calmars, seiches, poulpes et ont la capacité de modifier dynamiquement leur apparence pour le camouflage et la signalisation. ^1-6 Cette capacité est prise en charge en partie par l'expansion zonale sélective des organes pigmentées appelées chromatophores. ^4,7-9 Chromatophores sont actionneurs souples qui contiennent un réseau de granulés de pigment nanostructurés confinés dans un saccule cytoelastic qui est ancrée radialement par des fibres musculaires. ^1,3 Comme ils sont actionnés, étendent des chromatophores de 500% dans la surface présentée à distribuer les granulés à travers l'organe. ^{3,7- , 10,11} Lorsque cette action est concertée sur un certain nombre de chromatophores, la coloration générale de l'animal est changé. Bien qu'il soit connu que les granulés de pigment contribuent à ce changement de couleur, leur composition reste inconnue. Nous décrivons une procédure pour isoler et purifier des pigments chromatophores qui peuvent être adaptés pour les futures études de composition.

<p class = "jove_content"> L'isolement des granules pigmentaires implique une extraction en plusieurs étapes, l' homogénéisation et la procédure de purification. ^3,12 Chromatophore tissu contenant est récolté par l' extirpation attention du céphalopode. Un procédé de digestion et de l'homogénéisation est ensuite utilisée pour dissocier le tissu environnant et séparer les cellules chromatophores. Les granulés nanostructurés sont ensuite isolés et purifiés à partir des chromatophores restantes en utilisant la sonication et centrifugation répétée. Après purification, les pigments sont extraits des granules dans un processus qui est adapté de l'extraction de couleur visible à partir des ailes de papillon en utilisant des solutions de méthanol acides. Microscopie électronique ¹³ à balayage (MEB) et spectrophotométrie sont utilisés pour confirmer que les pigments de chromatophores sont extraits avec succès en utilisant ce processus.

Cette méthode décrit l'isolement des granulés de chromatophores qui est utilisé pour explorer la contribution moléculaire à coloration dans les céphalopodes. ¹² petites extractions de molécules provenant d' animaux entiers peuvent souvent être un processus long et fastidieux. Le but ici est d'informer les futurs chercheurs d'un protocole efficace et facile pour l'acquisition de pigments des granules nanostructurés en céphalopodes.

Protocol

études sur les animaux invertébrés effectuées ici ne sont pas réglementés aux États-Unis; par conséquent, le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux n'a aucune autorité pour l'examen de ces protocoles. Au lieu de ceux-ci ne relevant de la compétence de la réglementation aux États-Unis, les auteurs, par les présentes affirment que ces études ont été menées avec un effort sincère envers l'utilisation éthique, les soins et le traitement de ces animaux, le nombre de personnes a été réduit…

Representative Results

Chromatophores sont disséqués à partir du D. pealeii dorsale manteau (Figure 1A, 1B). Une fois qu'ils sont retirés, les chromatophores sont lysées et purifiées en utilisant des cycles de centrifugation et de lavage pour isoler les granulés pigmentés (figures 2A, 2B). Des solutions de méthanol acide (HCl-MeOH) sont utilisées pour extraire le pigment à partir des granulés (figure 2C),</stro…

Discussion

Nous avons démontré une méthode pour extraire les pigments de granulés de chromatophores calmar. En ciblant spécifiquement les granules, notre objectif est de déterminer leur rôle dans la médiation de la coloration adaptative. Cette méthode diffère des précédents rapports conçus pour caractériser les pigments de céphalopodes en utilisant des échantillons de tissus en vrac ¹⁴ ou lyophilisé la peau ^15.

Bien que ce protocole est efficace pour l'extract…

Materials

Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant