Um método para extrair Pigmentos de Squid<em> Pealeii Doryteuthis</em

Summary

Um protocolo para a extração de pigmentos a partir dos grânulos nanoestruturados em lulas Doryteuthis pealeii cromatóforos é apresentado.

Abstract

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Introduction

Cefalópodes, tais como lulas, chocos, polvo e tem a capacidade de alterar dinamicamente a sua aparência para camuflar e sinalização. ^1-6 Esta capacidade é apoiado em parte pela expansão de área seletiva de órgãos pigmentadas conhecidos como cromatóforos. ^4,7-9 Cromatóforos são actuadores macias que contêm uma rede de grânulos de pigmento nanoestruturados confinados dentro de uma sáculo cytoelastic que está ancorado radialmente por fibras musculares. ^1,3 Como eles são actuados, chromatophores expandir por 500% da área de superfície apresentada a distribuição dos grânulos durante todo o órgão. ^{3,7 , 10,11} Quando esta acção concertada ao longo de um número de chromatophores, a coloração geral do animal é alterada. Embora se saiba que os grânulos de pigmento contribuir para esta mudança de cor, a sua composição permanece desconhecido. Descreve-se um processo para isolar e purificar chromatophore pigmentos que podem ser adaptados para futuros estudos de composição.

<p class = "jove_content"> O isolamento de grânulos de pigmento envolve a extração de várias etapas, homogeneização, e processo de purificação. ^3,12 chromatophore tecido contendo é colhido através de extirpação cuidado do cefalópode. Um processo de digestão e homogeneização é então utilizado para dissociar o tecido circundante e separar as células chromatophore. Os grânulos nanoestruturados são, em seguida, isolado e purificado a partir das chromatophores restantes usando sonicação e centrifugação repetida. Após purificação, os pigmentos são extraídos a partir dos grânulos em um processo que é uma adaptação da extracção de cor visível de asas de borboleta usando soluções de metanol ácidas. Microscopia de electrões ^{13 de} varredura (SEM) e espectrofotometria são usados para confirmar que os pigmentos chromatophore são extraídas com sucesso usando Este processo.

Este método descreve o isolamento de grânulos chromatophore que é usado para explorar as contribuições para C molecularesoloration em cefalópodes. ¹² extrações de moléculas pequenas de animais inteiros muitas vezes pode ser um processo longo e tedioso. O objetivo aqui é informar futuros pesquisadores de um protocolo eficaz e fácil para a aquisição de pigmentos a partir dos grânulos nanoestruturados em cefalópodes.

Protocol

estudos com animais invertebrados aqui realizados não são regulamentados nos Estados Unidos; Por conseguinte, o Comité Cuidado e Uso Institucional animal não tem autoridade para revisão de tais protocolos. Em vez de estes não estão sob a jurisdição da regulação nos Estados Unidos, os autores declaram que estes estudos foram realizados com esforço sincero para o uso ético, cuidado e tratamento destes animais, o número de indivíduos foi minimizado e estes esforços são consistentes com a Declaração de Basileia e do Conselho …

Representative Results

Cromatóforos são dissecados a partir do D. pealeii manto dorsal (Figura 1A, 1B). Uma vez que são removidas, chromatophores são lisadas e purificada utilizando ciclos de centrifugação e lavagem para isolar os grânulos pigmentados (Figuras 2A, 2B). Soluções de metanol ácido (HCl-MeOH) são usadas para extrair o pigmento a partir dos grânulos (Figura 2C), obtendo-se um extracto de pigmen…

Discussion

Nós demonstramos um método para extrair pigmentos a partir de grânulos chromatophore lula. Alvejando especificamente os grânulos, o nosso objectivo é determinar seu papel na mediação coloração adaptativa. Este método difere relatórios anteriores concebidos para caracterizar pigmentos cefalópodes utilizando amostras de tecidos em massa ¹⁴ ou liofilizados pele ^15.

Embora este protocolo é eficaz na extração de pigmentos chromatophore, ela é limitada a peque…

Materials

Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant