Abstract
Les plantes peuvent produire des substances précieuses telles que des métabolites secondaires et de protéines recombinantes. La purification de ce dernier à partir de la biomasse végétale peut être rationalisé par traitement thermique (blanchissement). Dispositif de blanchiment peut être conçu plus précisément si les propriétés thermiques des feuilles sont connues en détail, à savoir la capacité de chaleur spécifique et de la conductivité thermique. La mesure de ces propriétés est de temps et de main-d'œuvre, et nécessite généralement des méthodes invasives qui entrent en contact avec l'échantillon directement. Cela peut réduire le rendement du produit et peut être incompatible avec les exigences de confinement, par exemple, dans le cadre de bonnes pratiques de fabrication. Pour répondre à ces questions, une méthode non-invasive, sans contact a été développé qui détermine la capacité thermique spécifique et la conductivité thermique d'une feuille de la plante intacte en une minute environ. Le procédé implique l'application d'une courte impulsion laser d'une longueur et d'une intensité définie à une petite zone de laExtrait de feuilles, ce qui provoque une augmentation de la température qui est mesurée au moyen d'un capteur proche infrarouge. L'augmentation de température est associée à des propriétés connues de la feuille (épaisseur et densité) afin de déterminer la capacité calorifique spécifique. La conductivité thermique est alors calculée en fonction du profil de la baisse de température ultérieure, en rayonnement thermique et le transfert de chaleur par convection en compte. Les calculs associés et les aspects critiques de la manipulation des échantillons sont discutés.
Introduction
Le traitement à grande échelle de matériaux biologiques nécessite souvent des étapes de traitement thermique telles que la pasteurisation. L'équipement pour de tels procédés peuvent être conçus plus précisément si les propriétés thermiques des matériaux biologiques sont bien caractérisés, y compris la capacité de chaleur spécifique (c p, s) et la conductivité thermique (λ). Ces paramètres peuvent être déterminés facilement pour les liquides, les suspensions et les homogénats par calorimétrie 1. Cependant, ces paramètres de mesure dans des échantillons solides peuvent être de main - d'œuvre, et nécessite souvent un contact direct avec l'échantillon ou même sa destruction 2. Par exemple, les techniques photothermiques exigent un contact direct entre l'échantillon et le détecteur 3. De telles limitations sont acceptables au cours de la transformation des aliments, mais sont incompatibles avec les processus fortement réglementés tels que la production de protéines biopharmaceutiques dans les plantes dans le cadre de bonnes pratiques de fabrication 4. jen un tel contexte, répété (par exemple, hebdomadaire) la surveillance des propriétés thermiques peut être nécessaire pendant une période de croissance de sept semaines pour les plantes individuelles comme un outil de contrôle de la qualité. Si un tel contrôle, il faudrait consommer une feuille et pour chaque mesure, il n'y aurait pas laissé la biomasse pour traiter au moment de la récolte.
En outre, en utilisant uniquement des pièces de feuilles à la place causerait blessant à l'usine et augmenter le risque de nécrose ou une infection pathogène, ce qui diminue encore le rendement du procédé. La probabilité d'une infection par un pathogène peut également augmenter si une méthode par contact direct avec l'échantillon serait utilisé, ce qui induit le risque que tout un lot de plantes peuvent être infectés par le contact avec un dispositif de capteur contaminé. Aspects similaires doivent être considérés pour la surveillance des plantes souligne comme la sécheresse, par exemple, dans un contexte écophysiologique. Par exemple, la perte d'eau est souvent suivie par un changement de la biomasse fraîche, ce qui nécessite une tre invasiveatment des plantes visées par l' enquête 5, par exemple, une feuille de dissection. Au lieu de cela, la détermination de la capacité thermique spécifique, qui dépend de la teneur en eau d'un échantillon, d'une manière non invasive comme décrit ici, peut être utilisé comme paramètre de substitution pour l'état d'hydratation des plantes. Dans les deux scénarios (production pharmaceutique et écophysiologie), les contraintes artificielles induites par des techniques de mesure destructrices ou invasives seraient nuisibles car ils peuvent fausser les données expérimentales. Méthodes flash Par conséquent, précédemment rapportés 6 ou le placement d'échantillons entre les plaques d' argent 7 ne sont pas adaptés pour de tels procédés et expériences , soit parce qu'ils nécessitent un contact direct avec l'échantillon ou sont destructrices. Les paramètres c p, s et λ doivent être déterminées afin de concevoir l'équipement de traitement pour une étape de blanchiment qui peut simplifier la purification du produit et de réduire ainsi les coûts de fabrication 8-10. Les deux cp, s et λ peuvent maintenant être déterminées rapidement par sans contact proche infrarouge non-destructif (NIR) laser de sondage d'une manière cohérente et reproductible 11 et cette nouvelle méthode seront expliquées en détail ci - dessous. Les résultats obtenus par cette méthode ont été utilisés avec succès pour simuler le transfert de chaleur dans les feuilles de tabac 12, ce qui permet la conception d' un équipement de traitement approprié et la sélection des paramètres correspondant tel que la température de blanchissement.
La méthode est facile à mettre en place (Figure 1) et comporte deux phases, la mesure et l' analyse, dont chacune comprend deux étapes principales. Dans la phase de mesure, un échantillon de la feuille est d'abord chauffée localement par une courte impulsion laser et la température maximale de l'échantillon est enregistrée. Le profil de température de l'échantillon est ensuite enregistrée pendant une durée de 50 s. Dans la phase d'analyse, les propriétés telles que la densité des feuilles (facilement et précisément déterminées par Measurem pycnométriqueent) sont combinés avec la température maximale de l' échantillon pour calculer c p, s. Dans la deuxième étape, le profil de température de la feuille est utilisée comme entrée pour une équation d'équilibre d'énergie, en prenant la conduction, la convection et le rayonnement en compte, pour le calcul de λ.
Des instructions détaillées étape par étape sont fournies dans la section de protocole, l'expansion sur le contenu de la vidéo qui l'accompagne. Mesures typiques sont ensuite présentés dans la section des résultats. Enfin, les avantages et les limites de la méthode sont mis en évidence dans la section de discussion ainsi que des améliorations potentielles et d'autres applications.
Figure 1: Appareil utilisé pour déterminer les propriétés thermiques des feuilles. A. Photographie de l'appareil de mesure utilisé pour déterminer la capacité de chaleur spécifique et de la conductivité thermique leaves. Les périphériques (ordinateurs, oscilloscope) ne sont pas représentés. B. Représentation schématique de l'appareil de mesure. Le laser et l'équipement connecté sont surlignés en rouge, le détecteur NIR pour la mesure de température est affichée en violet, l'échantillon des feuilles est vert et le capteur de puissance de photodiode est bleu. C. Dessin des éléments de la configuration de mesure avec le même code couleur que dans B. La barre de taille indique 0,1 m. D. Capture d'écran illustrant les éléments typiques du logiciel de contrôle de laser. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. La culture des plantes et préparation d'échantillons
- Rincer chaque bloc de laine minérale avec 1-2 litres d'eau déminéralisée, puis avec 1 L de 0,1% [m / v] Solution d'engrais. Placer un tabac (Nicotiana tabacum ou N. benthamiana) graine dans chaque bloc et rincer doucement avec 0,25 L de solution d'engrais sans se laver la postérité.
- Cultiver les plantes pendant 7 semaines dans une serre ou phytotron avec 70% d' humidité relative, une photopériode de 16 h (180 pmol s - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) et une température / sombre 25/22 ° C lumière régime.
- Déplacer les végétaux vers l'appareil de mesure. Si les plantes sont des feuilles simples de récolte immobile pour la mesure de propriétés thermiques.
2. Déterminer l'épaisseur des feuilles et de la densité
- Déterminer l'épaisseur de la feuille
- Préparer une [m / v] solution à 2% d'agarose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) etl'autoclave lui. Laisser la solution refroidir à 40 ° C et incorporer un échantillon de feuille placé dans une boîte de Pétri. Solidification de l'agarose en plaçant la boîte de Petri dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant 30 min.
- Couper le bloc d'agarose en tranches de 200 um en utilisant un vibratome avec un angle de coupe de lame de rasoir de 15 °. Utiliser une vitesse de coupe de 1,0 mm s -1 et une amplitude de 0,5 mm.
- Mont cinq Les sections transversales de feuilles sur une lame de verre en utilisant cyanoacrylate comme fixateur. Déterminer l'épaisseur de la feuille sous un microscope avec un objectif 20x et un oculaire avec un grossissement de 10 x en utilisant les outils de mesure intégrés au logiciel de microscope selon les instructions du fabricant.
- Déterminer les épaisseurs de feuilles dans les zones d'échantillonnage sans veines.
- Vous pouvez également déterminer l'épaisseur de la feuille avec un cadran de calibre à une zone de libre veine du limbe. Assurez-vous que le cadran de calibre est maintenue perpendiculaire au plan de la lame de feuille.
CAUTIONN: cyanoacrylate est un irritant pour la peau et peut également coller les doigts ensemble sinon manipulés avec soin.
- Déterminer la densité des feuilles
- Déterminer la masse à vide (m 0) d'un pycnomètre, puis le remplir avec de l' eau et de déterminer la masse à nouveau (m 1). Sécher le pycnomètre complètement, placez une feuille à l' intérieur et déterminer la masse (m 2) une fois de plus. Avec la feuille à l' intérieur, remplissez soigneusement le pycnomètre avec de l' eau et déterminer la masse (m 3).
- Calculer la densité de la feuille (P) en utilisant l' équation 1.
L'équation 1:
3. Déterminer la transmission spectrale et la réflexion des feuilles
- Placez une feuille dans la chambre d'un spectrophotomètre UV / VIS de l'échantillon en le fixant entre des pinces de maintien d'échantillon. Pour les mesures de transmission, placer la feuille devant det ecteur. Pour la réflexion des mesures placent la feuille à l'arrière de la chambre de détection.
- Lancez le logiciel de contrôle de spectrophotomètre. Sélectionner un spectre allant de 900 nm à 1600 nm. Démarrer une nouvelle analyse et d' enregistrer les valeurs de transmission (μ T) et de réflexion (μ R) affichée par le logiciel spectrophotomètre UV / VIS, basé sur la courbe spectrale.
- Effectuer toutes les mesures avec au moins trois répétitions biologiques. Augmenter le nombre de répétitions biologiques à cinq ou plus si une qualité d'échantillon hétérogène peut être prévu, à savoir, la variation de la morphologie et de l' épaisseur de la surface de la feuille.
- Calculer la puissance de transmission (P T) et de réflexion (P R) en multipliant la μ T mesurée ou des valeurs u R par le laser de puissance laser P mesurée selon les équations 2 et 3.
Équation 2:ftp_upload / 54835 / 54835eq2.jpg "/>
L'équation 3:
REMARQUE: La transmission peut également être déterminée avec un capteur de photodiode pendant la mesure (voir 6.3).
4. Mettre en place l'appareil de mesure
- Monter une barre-NIR diode laser à fibre couplée (longueur d'onde = 1,550 nm) dans un cône de diamètre 25,4 mm sur un support en acier inoxydable. Connectez un contrôleur pour régler la puissance de sortie (P Laser) du laser NIR à 4-6 W.
- Placer une lentille biconvexe avec une distance focale de 25,4 mm à l'extrémité du cône pour régler la largeur de faisceau de 13 mm.
- Placer un capteur de puissance de la photodiode 354 mm en dessous du bas de la lentille. Ensuite, atténuer la photodiode en plaçant un filtre de densité neutre ayant une densité optique de 1,0 et une couche céramique de 22 mm au-dessus du capteur.
- Connecter le capteur de puissance de photodiode à un oscilloscope à l'aide d'un câble coaxial.
- Relierun cadre de 10 x 10 cm qui a un échantillon cm zone 6 × 6 d'exposition avec l'échafaudage de la configuration de mesure à une hauteur de 308 mm au- dessous de la lentille (figure 1). Fixer la position de la feuille dans l'espace par son montage dans le châssis 10 cm × 10.
- Connecter un détecteur NIR à un ordinateur personnel à l'aide d'un câble de bus série universel (USB) et installer le logiciel d'interface pour le détecteur.
- Placer le détecteur à un angle de 45 ° par rapport au faisceau laser de 135 mm au-dessus de la couche de céramique. Aligner la zone de mesure du détecteur à spot laser sur l'échantillon en faisant varier la position du capteur et de l'angle jusqu'à ce que le signal de température maximale est observée.
- Utiliser le logiciel d'interface de commande de laser pour ajuster la puissance laser de sortie à 5 W et la durée de l'impulsion laser à 0,5 s. Sélectionnez la commande "commande actuelle" dans la fenêtre des options de contrôle ci-dessous la représentation graphique de la puissance du laser et d'ajuster la puissance du laser en tapant "5" dans le & #34; Puissance [W] ". Champ Régler la durée de l'impulsion laser en tapant" 0,5 "dans le" Temps [s] "champ.
- Pour déterminer la puissance du laser absolu pour chaque série d'expériences, remplacer le capteur de courant de la photodiode avec un capteur de puissance d'absorption thermique de surface à la fin de chaque série d'expériences et de mesurer la puissance de sortie du laser pendant 20 s sans échantillon.
5. Préparer les échantillons de feuilles
- Utilisez des feuilles intactes et en bon état pour les mesures.
- Si pertinent pour l'enquête, imiter typiques types de dégâts de feuilles en perçant la feuille avec un scalpel, en se frottant la feuille entre les gants en latex, exposant la feuille à une flamme nue ou d'un faisceau laser pour 2-3 s, ou utiliser d'autres techniques pour simuler d'autres types de dommages.
- Soigneusement mais rapidement monter l'échantillon de feuille entre les pinces de maintien d'échantillon.
6. Prendre les mesures de température
- Éviter tout contact direct entre la feuille et la céramiqueatténuateur placé au- dessus du capteur de photodiode pour empêcher le transfert de chaleur artificielle qui interfère avec le calcul de c p, s et λ (voir section 9).
- Utiliser le logiciel de mesure de la température pour recueillir le profil de température de l'échantillon de feuille pour un total de 60 s par le biais du détecteur PIR. Tout d'abord, notez la ligne de base de la température pendant 10 s, puis activer le laser pendant 0,5 s et poursuivre la collecte de données pour 49,5 s.
- Démarrer une mesure en cliquant sur "Mesure", puis "New Measurement". Ensuite, cliquez sur la flèche verte au-dessus de la représentation graphique du profil thermique. Enregistrez le profil de température en cliquant sur l'icône "Enregistrer" (disque stylisé) au-dessus de la représentation graphique du profil.
- Vérifiez la puissance du laser transmis en utilisant le capteur de puissance de photodiode en calculant la différence de signal pour les mesures avec et sans un échantillon de feuille en utilisant un oscilloscope connectéau capteur de puissance de la photodiode par l' intermédiaire d' un câble coaxial (figure 2).
- Déterminer la hauteur des deux flancs (f 1, f 2 et S, S) dans le profil de tension acquise par l'oscilloscope.
- Répéter la mesure sans échantillon de feuille de référence (f 1,0 et f 2,0). Calculer la transmission μ T comme le rapport de ces mesures en fonction de l' équation 4 (voir aussi la figure 2).
L'équation 4:
Figure 2: Mesure de la transmission de la feuille en utilisant un capteur de courant de photodiode. A. profil de tension typique pour une expérience de référence sans un échantillon de feuille visualisée à l'aide d'un oscilloscope. B. profil de tensionavec un échantillon de feuille monté dans l'appareil. Dans les deux cas, la puissance du laser transmise est proportionnelle à chacun des deux flancs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
7. Calculer la capacité spécifique de chaleur de l'échantillon Feuille
- Calculer la différence de température maximale AT [K] au cours de l'impulsion laser en soustrayant la température ambiante T 0 [K] de la MA maximale T x température de la feuille [K] (équation 5).
L'équation 5:
- Calculer l'énergie absorbée par une feuille (F S [J]) sur la base de la puissance du laser et le laser durée d'impulsion efficace (équation 6), où P R [W] est la puissance laser réfléchi et P T [W] est transmise par laser Puissance.
Equation 6:
- Calcul de la masse de la surface de la feuille chauffée (m S [kg]) en utilisant l' équation 7, où d S [m] est l'épaisseur de feuille selon la 2.1), r Laser [m] est le rayon du spot laser, V S [ m 3] est le volume de la feuille chauffée et ρ S [kg.m -3] est la densité de la feuille selon la 2.2).
Équation 7:
- Calculer c p, s [J kg -1 K -1] en fonction de l' équation 8 en divisant l'énergie absorbée E S par le produit de la surface foliaire chauffée masse m S et maximale différence AT de la température.
Équation 8:
8. Préparer les données Température de profil pour ThermCalculs al Conductivité
- Utilisez la commande "Exporter" du logiciel de commande de capteur NIR pour exporter les données brutes temps et de température en tant que fichier .dat * et ouvrez le fichier dans un tableur.
- Appliquer 1: 100 la réduction des données, par exemple, en utilisant un "IF (MOD (Value; 100) = 0;" x "," 0 ")" commande, ce qui entraîne une densité de données d'un point de données pour 0,1 s.
- Calculer la moyenne de référence température T B [° C] pour chaque profil de température au cours des 10 premières secondes de la mesure, pendant laquelle le laser était encore éteint. Ensuite, calculer la différence entre T B et la température ambiante réelle T 0 [° C].
- Utiliser cette différence pour normaliser individuellement chaque profil en le déplaçant vers T 0 (y-normalisation), par exemple, si T B - T 0 = 2,0 K, alors soustraire 2,0 K à partir de chaque valeur de température à la température profile (figure 3A).
- Normaliser la coordonnée temporelle de chaque profil de température (x-normalisation) en supprimant tous les points de données avant que la température de l' échantillon maximale (T max) et assigner de nouvelles valeurs de temps à partir de t = 0 à T max (figure 3B).
- Écran chaque profil pour les changements de température brusques, à savoir, les différences de température qui sont plus de trois fois le niveau de bruit de base, qui est généralement de 3 × 0,31 K ≈ 1,0 K. Enlevez ces régions de l'ensemble de données , car ils correspondent à la mesure des artefacts (figure 3C ).
- Monter une fonction de décroissance exponentielle (équation 9) pour les données à l' aide d' un processeur de feuille de calcul, où T t [K] est la température de l' échantillon de la feuille équipée au temps t [s], T 0 est la température ambiante, A [K] est l'amplitude et t 1 [s] la constante de désintégration (Figure3D).
Équation 9:
- Utilisez la fonction équipée pour calculer la baisse de la température dans l'échantillon de feuille 0-80 s après l'impulsion laser.
- Transformer les données de température mesurées en [° C] à la [K] échelle en ajoutant une valeur de 273,15 à chaque point de données de température (Figure 3E).
Figure 3: Données schéma de traitement pour le calcul de λ. A. Après réduction des données, les profils de température sont normalisés à la température ambiante. B. Ensuite, tous les points de données avant que la température de l' échantillon maximale (T max) sont enlevés. C. artefacts de mesure (indiqué dans l'ensemble de données «incompatible») sont identifiés en fonction de la température se déplace plus grand que eree fois le bruit de référence et retiré de l'ensemble de données avant le montage à une fonction exponentielle. D. L'échelle de température Celsius est convertie en échelle Kelvin. E. Pour chaque intervalle de temps, λ est calculé en fonction du profil de température. F. Une fenêtre de 20 s est défini dans lequel un changement de température correspondante peut être observée. G. Sur la base de la fenêtre de temps sélectionnée, la moyenne et l' écart - type sont calculés pour λ. H. Les résultats représentatifs pour deux échantillons de feuilles N. tabacum différentes. les flèches et les lignes orange indiquent l'effet de l'étape de traitement correspondant sur les données présentées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
9. Calcul de la conductivité thermique de l'échantillon Feuille
- Calculer la différe de températurence entre l'échantillon de feuille et de l'environnement pour chaque 0,1 s intervalle d' après l'équation 10, où AT x [K] est la différence de température T T [° C] est la température de l' échantillon de feuille ajustée et T 0 [° C] la température ambiante (Figure 3E).
Equation 10:
- Supposons que la baisse de la température est due à l'effet combiné du transfert de chaleur par convection, rayonnement thermique et la conduction thermique. Utiliser le bilan énergétique correspondant (équation 11) comme base pour le calcul de λ, où AE Temp [J] est la différence de l'énergie thermique de l'échantillon en deux points de temps consécutifs, AE rad [J] est la différence d'énergie due au rayonnement thermique, AE conv [J] est la différence d'énergie due à un transfert de chaleur par convection, et Δ; E cond [J] est la différence d'énergie due à la conduction thermique.
Équation 11:
- Substituer les termes généraux dans le bilan énergétique avec les propriétés physiques réelles donnant l' équation 12, où AT t [K] est la différence dans la température de l' échantillon de la feuille équipée, ε l'émissivité unitless, σ [kg s -3 K -4] Stefan constante -Boltzmann, A rad [m 2] de la zone de rayonnement thermique, h [-1 m J -2 K -1] le coefficient de transfert de chaleur par convection, A conv [m 2] le domaine du transfert de chaleur par convection, A cond [m 2] la zone de conduction thermique et l [m] la longueur caractéristique.
Équation 12:
- Calculer le charalongueur l cteristic basée sur la corrélation: L = V / A.
- Utiliser le volume de l' échantillon chauffé V S et la surface en coupe transversale de l'échantillon de feuille de calcul A [m 2]. La surface des feuilles en section transversale correspond à un selon l'équation cond 13, où A est dir la zone où a lieu la conduction, r le rayon laser est du spot laser et d est l'épaisseur de la feuille.
Équation 13:
- Calculer A rad et A conv selon l'équation 14, où un laser est la zone du spot laser.
Équation 14:
- Equations de substitution 9, 12 et 13 dans l' équation 11 et de résoudre ce dernier pour λ, ce qui donne l' équation 15 où t Laser est til durée d'impulsion laser [s].
Équation 15:
- Supposons une valeur de 0,94 pour ε et calculer λ pour chaque intervalle de 0,1 s de temps au cours des 20 premières secondes du profil de température. La moyenne des valeurs de 200 pour λ obtenu de cette façon et calculer l'écart type (Figure 3F - H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mesure des propriétés des feuilles
En utilisant le procédé ci - dessus microscopique, une épaisseur de feuille de 0,22 à 0,29 x 10-3 m a été déterminé à la fois de N. tabacum (0,25 ± 0,04 x 10-3 m, n = 33) et N. benthamiana (0,26 ± 0,02 x 10 - 3 m, n = 24), ce qui est bien dans la 0,20 à 0,33 × 10 - gamme de 3 m précédemment rapporté pour les feuilles de diverses espèces végétales 3. Déterminer l'épaisseur d'une ligne à voie a abouti à des valeurs de ~ 0,28 × 10-3 m (n = 10), ce qui est à l'intérieur d' un écart - type des résultats de la mesure au microscope. Ainsi, la mesure cadran calibre peut être préféré à la méthode microscopique pour déterminer l'épaisseur dans les applications de routine car il était plus facile à appliquer etles résultats pour c p, s et déviés ʎ moins de 10% par rapport à la technique plus de main - d'oeuvre. La densité de N. tabacum et N. benthamiana feuilles était de 750 ± 10 kg m - 3 (n = 20), qui correspond à la 631-918 kg m - 3 plage précédemment rapporté pour les feuilles dans d' autres espèces 3.
Calcul de la capacité thermique spécifique
Les profils de température collectées pour les espèces Nicotiana ont montré une augmentation rapide pendant la durée de l'impulsion laser jusqu'à ce que la température maximale (T max) a été atteint en moins de 1 s. Après l'impulsion, la température a diminué de façon exponentielle jusqu'à ce qu'il atteigne la température ambiante (T 0) (figure 3A - E). La capacité calorifique spécifique (C p, s -1 K -1 pour N. tabacum et 2252 ± 285 J kg -1 K -1 pour N. benthamiana. Deux réglages de culture et la durée ont été utilisés pour chaque espèces (voir section 1.2) , mais cela n'a pas affecté c p, s (figure 4). Cependant, les valeurs du c p, diminué linéairement de l'ancien ( en bas) pour les jeunes ( en haut) feuilles (R 2 = 0,85) dans le cas de N. tabacum (figure 4A), qui en corrélation avec la teneur en eau [gg -1 biomasse] qui avait été déterminée comme étant la différence de biomasse humide au moment de la récolte et de la masse après 72 h d' incubation à 60 ° C 11. Cette corrélation entre la teneur en eau et la capacité thermique spécifique était en accord avec les observations précédentes par d' autres auteurs 13. Une corrélation inverse a été observée pour N. benthamiana (R 2 = 0,79), où la différence entre les capacités thermiques spécifiques de feuilles de différents degrés de maturité (bas = vieux, top = jeunes) étaient seulement 13% par rapport à 21% pour N. tabacum. Cette différence peut provenir du fait que la teneur en eau dans des feuilles de N. benthamiana est presque constante sur les différents degrés de maturité des feuilles 11. Une analyse de sensibilité a révélé que les différences de c p, s sont proportionnelles aux variations des paramètres de mesure dans l' équation 8. L'effet de la lumière réfléchie et la puissance du laser transmise a été sous-proportionnelle, puisque ces paramètres ne sont pas des facteurs individuels dans l' équation 7. En conséquence, l'effet des erreurs de ces deux paramètres est plus faible que celles causées par les fluctuations de la puissance laser ou à la température ambiante. D'une manière générale, la mesure a été considérée comme fiable car tous les paramètres intervenant dans le calcul de c p, s avait un coefficientvariation de moins de 10% (figure 4C et D).
Figure 4: capacité thermique spécifique et de la conductivité thermique des valeurs déterminées pour N. tabacum et N. benthamiana. A. Capacité spécifique de chaleur et de la conductivité thermique de N. tabacum feuilles selon la position de la feuille sur la plante ( en bas = vieilles feuilles; milieu = feuilles matures; dessus = jeunes feuilles). Les étoiles et les triangles indiquent les plantes qui étaient âgés de 49 et 56 jours, respectivement. B. La capacité thermique spécifique et de la conductivité thermique des feuilles de N. benthamiana en fonction de la position de la feuille de la plante. Les étoiles et les triangles indiquent les plantes qui ont été cultivées dans un phytotron ou en serre, respectivement. C. La sensibilité des valeurs spécifiques de la capacité calorifique aux variations des paramètres d'entrée. Triangles présentent des valeurs de capacité thermique spécifique résultant d'une augmentation de 10% (rouge, vers le haut) ou diminution (bleu, vers le bas) dans les paramètres du modèle unique. D. La sensibilité des valeurs de conductivité thermique à des variations des paramètres d'entrée. Triangles marquent chaussures valeurs de conductivité thermique résultant d'une augmentation de 10% (rouge, vers le haut) ou diminution (bleu, vers le bas) dans les paramètres du modèle unique. Les barres d'erreur dans A et B indiquent l'écart type (n ≥ 3), tandis que dans C et D, ils représentent la gamme complète des valeurs obtenues lors de 10% des analyses de sensibilité de variation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Calcul de la conductivité thermique
La conductivité thermique (ʎ) a été calculée à partir des profils de température par exponentielleraccord (Figure 3) combiné avec les équations de transfert de chaleur par conduction et convection, ainsi que le rayonnement thermique. L' équation 15 a abouti à des valeurs moyennes de 0,49 ± 0,13 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 19) pour N. tabacum et de 0,41 ± 0,20 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 25) pour N. benthamiana. Il n'y avait pas de corrélation entre ʎ et âge de la plante ou la mise en culture, même si une corrélation entre l'âge des feuilles et ʎ a été observée pour N. benthamiana (figure 4B), en accord avec précédemment rapportés différences d'âge dépendant d'autres espèces de plantes 14. Tel que discuté ci - dessus, la teneur en eau était peu probable que la raison de cette différence comme il a été trouvé être homogène à travers les feuilles de maturité variable pour N. benthamiana. Au lieu de cela, nous spéculons que les changements dans la lEAF tissu, par exemple, la composition de la paroi cellulaire, sont responsables de cette observation en modifiant les propriétés de transfert thermique des feuilles et affectant ainsi la valeur de ʎ. La détermination de ʎ est sensible aux variations de la température ambiante. Une analyse de sensibilité a révélé que les fluctuations de ± 2,3 K modifié la valeur de ʎ par 64-125%. Selon l'équation 15, la température ambiante a un effet par la puissance de quatre sur le rayonnement thermique et donc une incidence directe sur la valeur de ʎ.
Évaluation de l'appareil de mesure
Il a été possible de mettre en place l'ensemble de mesure à moins de 3 h. Une fois cette étape terminée, le temps de démarrage du système était d'environ 15 min par série de mesures. Des mesures uniques ont moins de 3 min, y compris la préparation de l'échantillon et le cycle de mesure entier. L'analyse du temps d'exposition au laser a révélé qu'unle temps de chauffage de 0,5 s conduit à une augmentation de température de 19,9 ± 4,3 ° C (n = 55) était le meilleur compromis entre la haute AT (obtenue par des impulsions laser longues) nécessaire pour un bon rapport signal sur bruit (SNR) , et la faible AT (réalisé par de courtes impulsions laser) nécessaire pour éviter des dommages aux tissus. des durées d'impulsion plus longue que 0,5 s ont donné lieu à la perte de masse de l'échantillon, ce qui reflète probablement l'évaporation de l'eau et / ou d'endommager le tissu de la feuille lorsque la température de l'échantillon atteint jusqu'à 70 ° C, tandis que seulement 42,9 ± 4,2 ° C (n = 55) ont été observés pour les impulsions laser de 0,5. Pour des durées de moins de 0,5 s, le bruit de la température de ± 0,31 K (écart type, n = 25) ont représenté plus de 5% des AT et était donc une partie importante de AT. En revanche, au bruit de 0,5 représentaient seulement 2,5% du signal et a donc été considéré comme insignifiant. En outre, les échantillons ne chauffent pas plus de ~ 45 ° C, qui estune température que les plants de tabac peuvent également être exposés dans le tropique naturel de l' habitat sous-tropique et qui est seulement préjudiciable aux espèces végétales présentes dans les habitats de la toundra 15. La densité de puissance du laser était de 170 kW par m 2, alors que le rayonnement solaire naturel est typiquement dans la gamme de 1,0 à 1,4 kW par m 2 16,17. Cependant, en raison du temps très court de l'impulsion, cette dose d'énergie plus élevée n'a probablement pas endommager le tissu de la feuille comme indiqué par une analyse microscopique publiée récemment 11. Les données de température utilisées pour calculer ʎ ont été limitées aux premières 20 s après l'impulsion laser parce que pendant cette période, a fait le bruit (± 0,31 K) représentent moins de 5% du signal de température de l'échantillon et est ainsi considéré comme insignifiant. Lorsque les données de température d'au - delà du cadre de la 20 de temps ont été utilisés, les valeurs calculées pour ʎ diminué (figure 3F). Une explication possible est que certaines des hypothèsesfait pour le calcul de ʎ n'a pas appliqué pour les faibles valeurs de AT. Surtout, le terme décrivant le rayonnement thermique dans l'équation 15 pourrait avoir été affectée car elle est affectée par la puissance selon la température. En outre, la surface foliaire entourant la place de l' échantillon exposé au laser aurait pu chauffer légèrement et donc peut - être pas été le dissipateur thermique idéal supposé dans le modèle en réduisant l'AT x efficace et , finalement , le ʎ calculé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La méthode de mesure non destructive sans contact décrite ci - dessus peut être utilisé pour déterminer c p, s et ʎ d'une manière simultanée et reproductible. Le calcul de ʎ en particulier dépend de plusieurs paramètres qui sont sensibles aux erreurs. Néanmoins, l'effet de ces erreurs est soit linéaire ou sous-proportionnelle, et le coefficient de variation pour tous les paramètres a été trouvée être inférieure à 10%. Même si la méthode peut donc être considérée comme robuste, quelques améliorations techniques peuvent être faits pour réduire les sources d'erreur restantes.
Montage de l'échantillon dans l'ensemble était techniquement difficile, car une surface de la feuille plate est préférable pour la mesure, mais l'échantillon a naturellement une surface ondulée. Ce problème pourrait être résolu par la conception d' un porte-échantillon dédié à la géométrie réglée avec précision à l'échantillon de la feuille, par exemple, l' épaisseur de la feuille et la largeur de serrage de l'échantillon dans le préfèreorientation capable. Cette approche rendrait les mesures plus reproductible, mais compromettrait la nature de la mesure sans contact, car un contact ferme entre l'échantillon et le support serait nécessaire pour tirer le plat de surface foliaire. Les avantages de l' utilisation de ce type de support seraient donc dépendent du contexte de la mesure, à savoir si la nature de précision ou sans contact de la mesure est la plus importante. En revanche, de telles considérations peuvent ne pas être du tout nécessaire pour les feuilles avec une surface plane en soi, par exemple, le riz et les espèces apparentées.
Transfert de chaleur par convection en raison du mouvement de l' air dans l'environnement de l'échantillon doit être maintenu à un minimum au cours des mesures parce que cela affecte fortement le calcul des deux c p, s et ʎ 18. L'appareil doit donc être situé loin des courants d'air générés par les systèmes de conditionnement d'air, radiateurs ou autres équipements, tels que l'ordinateur avecventilateurs de refroidissement intégrés. Cela est également important parce que les changements dans la teneur relative en eau des feuilles 19 qui pourraient survenir avant ou pendant la mesure en raison de l' évaporation, qui peut être augmenté par des mouvements d'air 20, ne sont pas pris en compte dans le modèle. Ainsi, les mesures, en particulier avec des feuilles détachées, doivent être effectuées rapidement, comme décrit dans la section du protocole pour éviter des erreurs lors de l'acquisition des données. Dans l'avenir, les effets de l'évaporation sur la mesure peuvent être réduits ou évités si la mesure est effectuée dans une chambre de mesure au moins partiellement fermée avec un contrôle de l'humidité mis en oeuvre.
La précision de c p, s et les valeurs ʎ peut être augmentée en mesurant les paramètres utilisés dans les équations correspondantes avec plus de précision. Dans le cas de c p, s ces paramètres sont la puissance du laser, le volume maximal et la température ambiante et de l' échantillon, soit le produit de laser superficie et l'épaisseur place, et la densité de l'échantillon (équation 8). Les deux derniers paramètres doivent être déterminées dans des expériences d'accompagnement de la mesure réelle et leur fiabilité peuvent être améliorées si plusieurs répétitions biologiques représentatifs sont testés. Cependant, même lorsqu'une mesure commutée jauge simple a été utilisée, la différence d'épaisseur de la feuille par rapport à une analyse microscopique était seulement 11%, ce qui affecte les valeurs calculées pour C p, s et ʎ par le même degré. En revanche, la température et la puissance du laser peuvent être surveillés tout au long de la mesure. La précision de c p, s peut être améliorée si ces données en ligne sont utilisés à la place des valeurs fixes pour la puissance du laser et de la température ambiante, et les données sont recueillies à l' aide de capteurs bien calibrés. Ces considérations valent également pour ʎ, mais la température ambiante et de l'échantillon sont des paramètres les plus importants parce que les deux affectent la valeur calculée par la puissance de quatre.
Le calcul actuel de ʎ était fondée sur plusieurs hypothèses concernant le transfert de chaleur par convection et le rayonnement thermique. Par exemple, l'émissivité (ε) et le coefficient de transfert thermique convectif (h) sont mesurées ou calculées explicitement dans la méthode présentée ci - dessus, mais ont été dérivées des publications antérieures 18,21. L'exactitude de ʎ pourrait donc être amélioré par la détermination de ces deux paramètres dans les conditions réelles de mesure. Cependant, en utilisant les données de la littérature pour les calculs néanmoins donné des valeurs ʎ qui étaient dans la plage déterminée expérimentalement pour d' autres espèces végétales pour lesquelles des propriétés similaires peuvent être attendus en raison de leur phylogénie des espèces Nicotiana et leur physiologie, à savoir, les plantes herbacées 3. Même si les valeurs de ε et h ont été modifiées sur toute la gamme précédemment pour ces valeurs dans les plantes, par exemple, de 0,93 à 0,98 pour ε 21, leur effet sur la valeur finale de ʎ était <10% et donc de la variation naturelle observée ici.
La méthode présentée ci-dessus est non seulement en mesure de déterminer les propriétés thermiques des feuilles indemnes intactes et des feuilles détachées, mais il a également correctement identifié différents types de dommages plus sévères introduites volontairement avant la mesure. Par conséquent, différents types d'échantillons de feuilles peuvent être facilement distingués, en fournissant un outil pour supprimer, avant l'analyse, des échantillons pauvres qui produiraient des données de faible qualité. Cette fonction pourrait être utilisée pour le contrôle de la qualité lors de la surveillance du matériel biologique, par exemple, des échantillons non conformes aux spécifications en termes de c p, s et ʎ pourraient être exclus du traitement ultérieur. Ce serait un atout dans le contexte d'un processus fortement réglementés tels que l' agriculture moléculaire 4.
Les avantages de cette nouvelle méthode par rapport à d'autres dansla littérature comprennent le traitement rapide de l' échantillon, un minimum de préparation, mesure simultanée et non destructive sans contact de c p, s et ʎ, et l'utilisation d'équipements communs qui peuvent être trouvés dans de nombreux laboratoires optiques. Cela facilitera les applications plus larges de la méthode par rapport à ceux qui nécessitent des dispositifs spécialisés et coûteux tels que calorimètres à balayage différentiel. En outre, la calorimétrie nécessite un contact direct avec l'échantillon 22 donc il y a un risque de dommages, et la méthode est généralement limitée à la mesure de la capacité thermique spécifique 22. En revanche, alors que l' imagerie thermique peut détecter une nécrose ou des changements physiques dans les feuilles ou de plantes entières d'une manière sans contact 23, il nécessite également une analyse d'image complexes et des dispositifs spécialisés dédiés 24 qui pourraient être surmontés dans le futur par des caméras infrarouges moins coûteux et plus puissants et accompagnant les périphériques. L'analyse spectrale est un autre contact-frProcédé ee pour l'analyse de la teneur en eau et teneur en chlorophylle 25, mais il n'a pas encore été utilisée pour déterminer la capacité thermique spécifique et / ou la conductivité thermique.
L'approche de mesure rapportée ici est une méthode robuste pour déterminer les propriétés thermiques des feuilles de la plante avec faibles coûts d'investissement et de temps de mesure courts. Il a été utilisé avec succès pour déterminer c p, s et ʎ dans N. tabacum et N. benthamiana, deux espèces qui sont pertinentes dans le domaine de l' agriculture moléculaire 4. Les valeurs calculées pour les deux paramètres en fonction des profils de température des feuilles étaient en bon accord avec ceux rapportés précédemment pour d' autres espèces de plantes 3. La méthode est non destructive, sans contact, et ne nécessite pas de préparation d'échantillon complexe, offrant des avantages sur toutes les autres méthodes actuelles pour l'analyse des propriétés thermiques. La conception simple peut également faciliter le développement de la main-heldispositifs d pour augmenter la flexibilité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" tube | Thorlabs | SM1L10E | Tube for fiber holder |
| Agarose | Sigma Aldrich | A0701 | Agarose |
| Bi-Convex lense f=25.4 | Thorlabs | LB1761 | Lense |
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | Thorlabs | PM100D | Console for thermal surface absorber sensor |
| Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO7104 | Oscilloscope |
| DMR light microscope | Leica | n.a. | Light microscope |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-2 | Pycnometer |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Fiber holder | Thorlabs | Fiber holder | |
| Forma -86 °C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Infrared Detector Optris CT | Optris | OPTCTLT15 | Infrared detector |
| Infrared Detector Software Compact Connect | Optris | n.a. | Control software for infrared detector |
| Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer | PerkinElmer | L1050 | UV/VIS Spectrophotometer |
| Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module | DILAS | M1F-SS2.1 | Laser |
| Laser cover | Amtron | LM200 | Laser Cover |
| Laser Driver | Amtron | CS 408 | Laser Driver |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Photodiode sensor | Thorlabs | PDA20H-EC | Power sensor for transmission measurements |
| Precision weight Ohaus Analytical Plus | Ohaus | 80251552 | Precision weight |
| Sample frame | Fraunhofer ILT | n.a. | Fixation of the leaf sample |
| Software Pyro Control | Amtron | n.a. | Laser Power Control Software |
| Stainless-steel-holder | n.a. | n.a. | Holder for measurement set-up |
| Teflon plates 2 cm | Fraunhofer ILT | n.a. | Teflon attenuation |
| Thermal surface absorber Power sensor | Thorlabs | S314C | Sensor for laser power measurements |
| Vibratome | Leica | 1491200S001 | Vibratome |
| Zoc/Pro 6.51 | EmTec Innovative Software | n.a. | Laser Control Software |
References
- Wilhelm, E. Heat Capacities: Liquids, Solutions and Vapours. , Royal Society of Chemistry. 516 (2010).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. J. Exp. Bot. 64, 3937-3949 (2013).
- Jayalakshmy, M. S., Philip, J. Thermophysical Properties of Plant Leaves and Their Influence on the Environment Temperature. International Journal of Thermophysics. 31, 2295-2304 (2010).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Schuster, A. C., et al. Effectiveness of cuticular transpiration barriers in a desert plant at controlling water loss at high temperatures. AoB PLANTS. 8, (2016).
- Parker, W. J., Jenkins, R. J., Abbott, G. L., Butler, C. P. Flash Method of Determining Thermal Diffusivity, Heat Capacity, and Thermal Conductivity. J Appl Phys. 32, 1679-1684 (1961).
- Hays, R. L.
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. Blanching intact leaves or heat precipitation in an agitated vessel or heat exchanger removes host cell proteins from tobacco extracts. J. Vis. Exp. , Under review (2015).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Tödter, N., Wehner, M. Determination of the thermal properties of leaves by non-invasive contact free laser probing. J. Biotechnol. 217, 100-108 (2016).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Hedlund, H., Johansson, P. Heat capacity of birch determined by calorimetry: implications for the state of water in plants. Thermochim Acta. 349, 79-88 (2000).
- Chandrakanthi, M., Mehrotra, A. K., Hettiaratchi, J. P. A. Thermal conductivity of leaf compost used in biofilters: An experimental and theoretical investigation. Environ. Pollut. 136, 167-174 (2005).
- Larcher, W. Physiological Plant Ecology: Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. , Springer Science & Business Media. (2003).
- Cowen, R. A gamma-ray burst's enduring fireball. Science News. 152, 197 (1997).
- Jones, H. G., et al. Thermal infrared imaging of crop canopies for the remote diagnosis and quantification of plant responses to water stress in the field. Funct. Plant Biol. 36, 978-989 (2009).
- Defraeye, T., Verboven, P., Ho, Q. T., Nicolai, B. Convective heat and mass exchange predictions at leaf surfaces: Applications, methods and perspectives. Comput. Electron. Agric. 96, 180-201 (2013).
- Arndt, S. K., Irawan, A., Sanders, G. J. Apoplastic water fraction and rehydration techniques introduce significant errors in measurements of relative water content and osmotic potential in plant leaves. Physiol. Plant. 155, 355-368 (2015).
- Jones, H. G., Schofield, P. Thermal and other remote sensing of plant stress. General and Applied Plant Physiology. 34, 19-32 (2008).
- Jones, H. G., Archer, N., Rotenberg, E., Casa, R. Radiation measurement for plant ecophysiology. J. Exp. Bot. 54, 879-889 (2003).
- Dupont, C., Chiriac, R., Gauthier, G., Toche, F. Heat capacity measurements of various biomass types and pyrolysis residues. Fuel. 115, 644-651 (2014).
- Chaerle, L., et al. Multi-sensor plant imaging: Towards the development of a stress-catalogue. Biotechnol. J. 4, 1152-1167 (2009).
- Hackl, H., Baresel, J. P., Mistele, B., Hu, Y., Schmidhalter, U. A Comparison of Plant Temperatures as Measured by Thermal Imaging and Infrared Thermometry. J. Agron. Crop. Sci. , 415-429 (2012).
- Yuan, L., et al. Spectral analysis of winter wheat leaves for detection and differentiation of diseases and insects. Field Crops Res. 156, 199-207 (2014).
