מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
העברת גנים והחלבונים ברמת המיקרו-האורגניזם משחקת תפקיד מרכזי הישרדות חיידקים ואבולוציה וכן תהליכי דלקת. חילופי DNA בין חיידקים או בין חיידק לתא יכולים להיות מושגים באמצעות תמרת טרנספורמציה, נטייה או וקטור. 1,2 הצמיד הוא ייחודי בהשוואה לטרנספורמציה התמרה ב שבמהלך הנטייה בין חיידקים גראם שלילית כגון Escherichia coli, העברת הד.נ.א מתרחשת באופן תורם שבשליטה לפיה מערכת מולקולארית מורכבת מתחברת תאים תורמים ומקבל. הצמיד הוא גם הדרך הישירה ביותר שבו תאי חיידקיים אינטראקציה עם תאים מארחים להזריק גנים, חלבונים או כימיקלים למערכות מארחות. 3 לעתים קרובות, העברת סוכנים כאלה יש השפעות מדהימות במארח, החלו בפתוגנזה ו סרטן לארח אבולוציה והתאמה. הוכח כי recombinatio conjugativen מגדיל את השיעור של פי 3 הסתגלות בחיידקים עם קצב מוטציות גבוה בתנאים של לחץ סביבתי. 4 יתר על כן, נטייה היא רחוק המסלול הנפוץ ביותר שדרכו גנים עמידים לאנטיביוטיקה ב זני חיידקים מפוזרים. 5,6
מיקרואורגניזמים התפתחו מערכות הפרשה מיוחדות כדי תומכים בטרנספר של מקרומולקולות על פני קרום תא; יש כיום 9 סוגים של מערכות הפרשת (TSSs) בחיידקים גרם שליליים כי תוארו: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, כמו גם ה- SEC (הפרשת) ו טאט (שני-ארגינין טרנסלוקציה) מסלולים. סוג 7,8 כל אחד מערכת הפרשת מחולק נוסף לתוך תת שונים, הכרח בשל מגוון של חלבונים וייחודו של מסלולים הנוגעים בדבר, על זני חיידקים שונים. לדוגמה, במערכת הפרשת סוג IV (T4SS), מערכות Ti ו CAG להקל התחבורה מפעיל ואילו F-פלסמיד, R27nd pKM101 T4SSs להקל על העברת פלסמיד conjugative. 7,9,10 הבנה מפורטת של המנגנונים שבאמצעותם אורגניזמים להרכיב מערכות ההפרשה שלהם מחלבוני הרכיב שלהם ולשתף תכנים סלולריים עם נמען או בסביבתם הקרובה מהווה גורם חשוב בהתפתחות של אסטרטגיות ממוקדות כדי להילחם מיקרואורגניזמים פתוגניים תהליכים של זיהום הסלולר.
בעקבות קוניוגציה זיהוי הראשונית ב E. coli על ידי לדרברג & טאטום, 11 מספר גדול של פלסמידים ניידים conjugative זוהה ואופיין. 12 פלסמידים ניידים כזה להראות מגוון רב הוא גודל (מ -1 עד מעל 200 kilobases (KB)), אולם כל פלסמידים הניידים מכילים relaxase, המכיר את המקור של העברה (אורית) ובכך מאפשר העברת הפלסמיד. פלסמידים Conjugative גנים לקודד נוספים להרכבה של T4SS פונקציונלי כמו גם סוגIV חלבון צימוד. 12 לדוגמה פלסמיד F 100 kb של E. coli מקודד כל הגנים conjugative בתוך אזור 33.3 kB העברה (tra). 13 הגנים באזור tra של לקודד פלסמיד F כל החלבונים המאפשרים היווצרות pilus, הזדווגות זוג היווצרות (MPF), העברת דנ"א פונקציות הדרה במהלך העברת פלסמיד conjugative. 10,14,15 גוף ידע משמעותי זמין עבור T4SSs conjugative, אולם כמפורט מחקרים מבניים של חלבונים מתחמי conjugative נעשים זמינים רק ולאחרונה. 16 – 28
כדי להרכיב תמונה מקיפה של תהליך conjugative, צימוד של מחקרים מבניים מפורטים מוטציוני ניתוחים של חלבוני הובלת conjugative נדרש. זו יכולה להיות מושגת באמצעות מבחני הזדווגות conjugative. עבור פלסמיד F, כל חלבון המקודד בתוך האזור tra ממלא תפקיד שיתוף F בתיווךnjugation; ולכן, בנוקאאוט / מחיקה של גן ההעברה יהיה לבטל את קיבולת conjugative של התא (איור 1). בעוד פלסמידים ניידים קטנים יותר יעילים הליכי מחיקה סטנדרטיים עבור פלסמידים conjugative גדולים כגון F, נוקאאוט גנטי מושגות בקלות רבה יותר באמצעות רקומבינציה הומולוגי שבו גן המטרה הוחלף שינוע אחד גן עמידות לאנטיביוטיקה ברור. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מעסיקים הומולוגיים להחליף גן העברת עניינים עם acetyltransferase chloramphenicol (CAT) פלסמיד F 55 kb נגזרת pOX38-Tc; 29,30 הפלסמיד בנוקאאוט כתוצאה, pOX38-Tc Δgene :: ס"מ, הופך לפשוט התנגדות לנוכחות של chloramphenicol (ס"מ) בתקשורת צמיחה. תאים תורמים מחסת pOX38-Tc Δgene :: סנטימטר אינם מסוגלים להשפיע העברת DNA conjugative / הזדווגות כפי שנצפה דרך השימוש של assay הזדווגות; את היעילות ההזדווגות של תא תורם pOX38-Tc Δgene :: ס"מ RECIP נורמליient יקטן או, לעתים קרובות יותר, יבוטל. העברת Conjugative של פלסמיד pOX38-Tc Δgene :: הסנטימטר ניתן לשחזר באמצעות פלסמיד התאוששות קטן מחסת גן ההעברה הממוקדת. פלסמיד התאוששות זו יכולה להיות אחת המספקת ביטוי המכונן, כגון pK184 פלסמיד (pK184-גן), 31 או אחד המספק ביטוי מושרה כל עוד פלסמיד כראוי מטרות הגן אל המיקום הנכון בתוך התא (הציטופלסמה או periplasm). כתוצאה מכך, מבחני ההזדווגות בין התורם החדש הזה (מחסה pOX38-Tc Δgene :: ס"מ + פלסמידים pK184-גן) תא לבין נמען, את יעילות ההזדווגות צפויה להחזיר כמעט לזה של assay הזדווגות תורם למקבל נורמלי. מערכת זו מאפשרת לחקור את הפונקציה של הגן בנוקאאוט דרך דור של סדרה של מבנים-גן pK184 (מחיקות או מוטציות נקודתיות) ובדיקה בכל היכולת לבנות כדי לשחזר את יכולת ההזדווגות של טיפוח pOX38-Tc Δgene :: ס"מ תא תורםים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תהליך קוניוגציה מספק שבאמצעותו החיידק עלול להתפשט גנים מתן יתרון אבולוציוני לצמיחה בסביבות מאתגרות, כגון התפשטות סמנים עמידות לאנטיביוטיקה. מכיוון שרבי פלסמידים conjugative כל כך גדולים, 12 מחקרים תפקודיים על חלבוני המעורבים הרכבה של מנגנון ההעברה באמצעות מוטציות …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי דיסקברי גרנט ממדעי הטבע וההנדסה המועצה של קנדה (NSERC).
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
Referências
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
- Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
- Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
- Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
- Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
- Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
- Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
- Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
- Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
- Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
- Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
- Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
- Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
- Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
- Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
- Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
- Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
- Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
- Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
- Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
- Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
- Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
- Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
- Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
- Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
- Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
- Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
- Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).
