細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
ミクロ生物レベルでの遺伝子やタンパク質の転送は、細菌の生存と発展だけでなく、感染の過程において中心的な役割を果たしています。細菌の間、または細菌と細胞間のDNAの交換は、形質転換、接合またはベクターの形質導入によって達成することができます。 1,2結合は、複雑な高分子システムがドナーとレシピエント細胞を接続することによりDNAの転移がドナー・制御された様式で発生し、 大腸菌などのグラム陰性菌間の共役中にその中の形質転換および形質導入と比較してユニークです。結合はまた、細菌細胞は、ホストシステムの中での遺伝子、タンパク質または化学物質を注入するために、宿主細胞と相互作用する最も直接的な方法です。 図3は、かなり頻繁に、このような薬剤の転送は、進化と適応をホストするために発病し、発癌に至るまで、ホスト上の顕著な効果を持っています。その接合recombinatioが示されていますnは環境ストレスの条件下で高い突然変異率を持つ細菌に適応3倍の速度を増加させます。 4さらに、結合は、はるかに菌株における抗生物質耐性遺伝子が拡散され、それを通して、最も一般的な経路です。 5,6
微生物は細胞膜を横切る巨大分子の転送をサポートするために特殊な分泌系を進化させてきました。 T1SS、T2SS、T3SS、T4SS、T5SS、T6SS、T7SS、ならびに秒（分泌）およびTat（2-アルギニン転座）：記載されているグラム陰性菌における分泌系（のTSS）の9種類が現在あります経路。分泌系の7,8各タイプは、さらに、異なるサブタイプに起因するタンパク質の多様性と異なる細菌株で、関与する経路の特殊性への必要性を分割されています。例えば、IV型分泌系（T4SS）で、TiおよびCAGシステムはF-プラスミド、R27 Aに対し、エフェクター輸送を促進しますND pKM101 T4SSsは、接合性プラスミドの伝達を促進します。生物はその構成タンパク質からそれぞれの分泌系を組み立てると、受信者またはその周囲の環境と細胞内容を共有するメカニズムの7,9,10詳細な理解は、病原性微生物やプロセスに対抗するための目標と戦略の開発における重要な因子であります携帯感染。
レーダーバーグ＆テイタムによって大腸菌での最初の同定細菌接合に続いて、モバイルおよび接合性プラスミドの11多数同定され、特徴付けられています。 12このようなモバイルプラスミドは、かなりの範囲は（1から200以上のキロベース（キロバイト）まで）のサイズであることを示す、しかしすべてのモバイルプラスミドは、それによって、プラスミドの伝達を可能にする転送（oriTを）の原点を認識しrelaxaseを、含まれています。機能T4SSの組み立てだけでなく、タイプの接合プラスミドさらにエンコード遺伝子IV結合タンパク質。 12例えば、 大腸菌の100キロバイトFプラスミドは33.3 kBの転送（TRA）領域内のすべての接合の遺伝子をコードしています。 13ペア形成（MPF）、DNA転移と除外機能を交配線毛形成を促進する全てのタンパク質、接合性プラスミドの転送中にFプラスミドエンコードのTRA領域における遺伝子。 10,14,15は、知識の重要な身体は、接合T4SSsのために利用可能である、しかし、唯一のより最近利用可能になってきている共役タンパク質との複合体の構造研究を詳述しました。 16から28
接合プロセスの包括的なビューを組み立てるためには、接合伝達タンパク質の変異分析に詳細な構造研究のカップリングが必要です。これは、接合交配アッセイを介して達成することができます。 Fプラスミドは、TRA領域内にコードされる各タンパク質は、F媒介コにおいて役割を果たすnjugation;従って、転写遺伝子のノックアウト/欠失は、細胞の接合容量（ 図1）を廃止します。小さい携帯プラスミドは、標準的な削除の手続きをより助長しているが、このようなFのようなより大きな接合プラスミドのために、遺伝子ノックアウトは、より容易に標的遺伝子は明確な抗生物質耐性遺伝子を伝えるものに交換され、相同組換えを介して達成されます。現在のプロトコルでは、我々は55キロバイトFプラスミドの誘導体pOX38-TCでクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）と利益の伝達遺伝子を置き換えるために、相同組換えを利用します。 29,30、得られたノックアウトプラスミド、pOX38-TCΔgene:: Cmが、増殖培地中のクロラムフェニコール（CM）の存在に対する抵抗性を促進します。 pOX38-TCΔgene:: Cmとを保有するドナー細胞は交配アッセイの使用を介して観察されるように接合DNA転送/交配に影響を与えることができません。 pOX38-TCΔgene:: Cmをドナー細胞と正常RECIPの接合効率ientは廃止され、より多くの場合、減少またはます。 pOX38-TCΔgene:: Cmをプラスミドの接合伝達を標的に転送遺伝子を保有する小型の回復プラスミドを経由して復元することができます。この回復プラスミドは、プラスミドpK184（pK184遺伝子）、31または限り、そのプラスミドが適切細胞（細胞質またはペリプラズム）内の正しい場所に遺伝子を標的として誘導性の発現を提供するものとして、構成的発現を提供するものであることができます。したがって、この新しいドナー間の交配アッセイ（pOX38-TCΔgene:: Cmを+ pK184遺伝子のプラスミドを有します） そして、レシピエント細胞は、接合効率はほぼその正常ドナー・レシピエントの交配アッセイのに復元することが期待されます。このシステムは、CM曲庇:: pK184-遺伝子構築物（欠失または点変異）の一連の生成を介してとpOX38-TCΔgeneの交配能力を回復するために各構築物の能力を試験するノックアウト遺伝子の機能を調べるために1を可能にしますドナー細胞秒。
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌接合プロセスは、細菌は、抗生物質耐性マーカーの普及など厳しい環境での成長のための進化上の利点を提供する遺伝子を広げることができる手段を提供します。接合性プラスミドの多くは非常に大きいので、接合プラスミド自体に標的遺伝子の突然変異によって転写装置の組み立てに関与するタンパク質上の12機能的研究は扱いにくいです。本明細書で詳細なプロトコルは、一…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、自然科学からディスカバリーグラント＆カナダのエンジニアリング評議会（NSERC）によってサポートされていました。
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
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