Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer Ischämie-Reperfusion (IR) Modell auf Mausohrhaut mit Magnetspann. Mit Hilfe eines speziell angefertigten intravital Bildgebung Modell untersuchen wir in vivo Entzündungsreaktionen post-Reperfusion. Das Grundprinzip hinter der Entwicklung dieser Technik besteht darin, das Verständnis zu verlängern, wie Leukozyten Haut IR Verletzung reagieren.
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) tritt auf, wenn eine vorübergehende Hypoxie aufgrund der Behinderung des Blutflusses (Ischämie) durch eine nachfolgende Wiedersauerstoffversorgung der Gewebe (Reperfusion) gefolgt ist. In der Haut, Ischämie-Reperfusion (IR) gilt als einer der Faktoren für die Pathophysiologie von Dekubitus zu sein, wo längere Bettruhe langfristige Krankenhauspatienten zu Verletzungen prädisponiert. Bei diesen Patienten sowohl die Haut und die darunter liegenden Muskeln sind ständig Gewichtsdruck ausgesetzt über Bereiche der Knochenvorsprung ausgeübt wird, in lokalisierten Verletzungen führt , die, wenn sie unbehandelt, nekrotischen 1 werden kann.
Die Schäden in einer IRI beteiligt sind zweifach. Während der Ischämie führt die Okklusion von Blutgefäßen zu einem drastischen Abfall der Sauerstoffzufuhr zu den Geweben. Dies führt zu einer Abnahme von ATP und pH, die ATPasen involviert in den Zellstoffwechsel inaktiviert. Im Gegenzug Spike zellulären Kalziumspiegel und gestresst oder c beschädigtells Apoptose oder Nekrose 2. Die Freisetzung von intrazellulären Inhalte oder Schäden associated molecular patterns (DAMP), wie HMGB1, trägt zu der entzündlichen Reaktion 3. Die zweite Beleidigung tritt während der Reperfusion. Obwohl Sauerstoff und pH-Werte während der Reperfusion wiederhergestellt werden, führt dies zu der Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die auf die Oxidation von intrazellulären Lipiden führt, DNA und Proteinen. Folglich werden pro-inflammatorischen Mediatoren aktiviert, die aus setzt eine sekundäre Entzündungsreaktion, die die Rekrutierung von Immunzellen zur Entzündungsstelle 2 umfasst. Während die Kaskade biochemischer Ereignisse bis zu der Entzündungsreaktion führen gut beschrieben worden ist, sind die räumliche und zeitliche Regulierung der Immunzellaktivitäten nicht gut verstanden.
Hier beschreiben wir eine robuste IR-Modell auf Mausohrhaut mit einfachen Magnetspann. In Verbindung mit Multiintravital Bildgebung (MP-IVM), werden wirwurde ein Modell , um die de – vivo – Entzündungsreaktionen zu untersuchen , die auftreten , nach der Reperfusion stattfindet. Der Grund für die Entwicklung und Anwendung dieser Technik ist, um zu versuchen, zu verstehen, wie sowohl interstitielle und infiltrierenden Zellen IR in Echtzeit zu antworten.
Bestehenden Modellen von IR die Spanntechnik auf der Haut Flanke verwenden , sind sehr invasiv, da sie die chirurgische Implantation von Stahlplatten in der Haut Flanke erfordern, so dass sie weniger als ideal für immunologische Studien 4. Eine ähnliche nicht-invasive Spanntechnik ist in der Maushaut Flanke 5,6 beschrieben. Da jedoch der Einbau der intravitalAbbildungsKomponente in diesem Verfahren haben wir stattdessen die Ohrhaut als IR Stelle gezielt, da sie Bewegungen aufgrund von Atem umgeht und bietet Stabilität 7,8 während der Bildgebung. Außerdem Leukozytenuntergruppen, die das Interstitium umspannen identisch sind zwischen dem Ohrhaut und der Haut flankieren, obwohl dieZahlen und Proportionen können geringfügig 9 variieren. Somit stellt die Ohrhaut eine ideale Abbildungsstelle.
Darüber hinaus abgerufen die meisten Daten aus diesen IRI Modelle sind begrenzt auf makroskopische Auswertungen (Einstufung von Geschwüren) und mikroskopische Analysen von Endpunktentzündungsindikatoren 10. Unter Verwendung dieses Modells Echtzeit-Visualisierung der zellulären Antwort von Neutrophilen nach der Reperfusion in der Haut eines fluoreszierenden Reporter Maus aktiviert. Eine zuvor veröffentlichte intravital Ohr Abbildungsmodell 8 mit zusätzlichen Modifikationen verwendet (1, 2).
Bedeutung
IR ist eine der führenden Ursachen von Haut Dekubitus. Die frühen Stadien (I und II) von Dekubitus beschreiben den Zustand der menschlichen Haut (wie auf die zugrunde liegenden subkutanen Gewebe und Muskeln im Vergleich). Allerdings fehlt ein Verständnis für die immunologische Ätiologie noch. Hier präsentieren wir eine einfache und robuste IR-Modell auf Mausohrhaut, um diese Lücke zu schließen. Wir simulieren Ischämie mit der Maus Ohr zwischen zwei Magneten Spann- und anschli…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Mice strains | |||
Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
PBS | |||
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
Ultrapurified water | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
High vacuum grease | Dow Corning | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | |||
TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Coverslip holder | |||
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Imaging analysis software | |||
Imaris v8.1.2 | Bitplane |