면역 반응의 생체 내에 다중 광자 이미징을위한 마우스 귀 피부에 유도 허혈 - 재관류 손상
Summary
이 프로토콜은 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 허혈 – 재관류 (IR) 모델의 유도를 설명합니다. 맞춤 제작 된 생체 내에 이미징 모델을 사용하여, 우리는 생체 내 염증 반응 후 재관류에서 공부합니다. 이러한 기술의 발달 배후의 이론적 근거는 백혈구 IR 피부 손상에 반응하는 방법에 대한 이해를 확장하는 것이다.
Abstract
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Introduction
과도 저산소증 인해 조직 (재관류)의 후속 재 – 산소화이어서 혈류 (허혈)의 폐색에있을 때의 허혈 – 재관류 손상 (IRI)가 발생한다. 피부, 허혈 재관류 (IR)의 연장 상 나머지 부상 장기 입원 환자 걸리기 욕창의 병태 생리에 기여 요인 중 하나라고 생각된다. 이러한 환자에서 피부와 기본 근육 모두 지속적으로 치료 왼쪽 경우, 괴사 하나가 될 수 지역화 부상의 결과로, 뼈 굴지의 영역에 걸쳐 작용 무게 압력에 노출되어있다.
IRI에 관련된 손해 배상은 두 가지입니다. 허혈, 혈관 폐색 조직 산소 전달의 급격한 저하로 연결. 이것은 세포 대사에 관여 -ATPase를 불 활성화 ATP 및 산도의 감소를 초래한다. 차례로, 세포의 칼슘 농도는 스파이크, 그리고 스트레스 또는 c를 손상ELL 학생은 세포 사멸 또는 괴사 (2)를받을. 세포 내 내용이나 손상 관련 분자 패턴 (DAMP)의 출시, HMGB1 같은 염증 반응 3에 기여한다. 두 번째 모욕은 재관류시에 발생합니다. 산소와의 pH 수치가 재관류 기간 동안 복원되지만,이 세포 내 지질, DNA 및 단백질의 산화를 유도 활성 산소 종의 발생 (ROS)을 초래한다. 따라서, 염증성 매개 물질은 염증 사이트 2 면역 세포의 채용을 포함하는 이차 염증 반응을 설정하는 활성화됩니다. 염증 반응에 이르기까지의 생화학 적 사건의 케스케이드 잘 설명 하였지만, 면역 세포 활동의 시공간적 조절은 잘 이해되지 않는다.
여기서 우리는 간단한 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 강력한 IR 모델에 대해 설명합니다. 광자 생체 내에 영상 (MP-IVM)와 결합하여, 우리재관류가 발생 후 발생하는 생체 내 염증 반응을 연구하는 모델을 설립했다. 이 기술의 개발과 사용의 뒤에 이론적 근거는 간질 및 침투 세포가 모두 실시간으로 IR에 어떻게 반응하는지 이해하려고 노력하는 것입니다.
그들은 면역 연구 4 이하보다 유용하게 활용할 피부 측면에서 강판의 외과 적 이식을 필요로 피부 측면에 클램핑 기술을 사용하여 IR 기존의 모델은 매우 침습적이다. 유사한 비 침습적 클램핑 기술은 마우스 피부 플랭크 5,6- 설명되었다. 이 호흡에 의한 움직임을 회피하고 -7,8- 촬상시 안정성을 제공하지만,이 때문에 방법에서 생체 내에 이미징 성분의 혼입, 우리는 대신, 표적 IR 사이트와 귀의 피부를 선택 하였다. 또한, 간질 걸쳐 백혈구의 서브 세트는 있지만, 귀 피부와 피부 사이의 동일 측면숫자와 비율은 약간 9 다를 수 있습니다. 따라서, 귀 피부 이상적인 촬상 부위를 나타낸다.
또한, 이러한 IRI 모델에서 검색 대부분의 데이터는 거시적 평가 (궤양의 등급) 및 엔드 포인트 염증 지표 (10)의 현미경 분석에 제한됩니다. 이 모델을 사용하여, 형광 리포터 마우스 피부 재관류 후 호중구의 세포 반응의 실시간 시각화를 사용할 수있다. 이전에 출판 생체 내에 귀 이미징 모델은 추가 수정 (도 1, 2)와 (8) 사용된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
의미
IR 피부 욕창의 주요 원인 중 하나이다. (배후 피하 조직 및 근육에 비해) 욕창의 초기 단계 (I 및 II)은 인간의 피부의 상태를 설명한다. 그러나, 면역 학적 원인에 대한 이해는 여전히 부족하다. 여기서,이 간극을 해결하기 위하여 마우스 귀 피부에 간단하고 강력한 IR 모델을 제시한다. 우리는 자석 제거 (재관류) 후 하류 면역 반응을 연구 두 개의 자석과 이후의 마우스 귀?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Materials
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
Referências
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- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
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