इस प्रोटोकॉल चुंबक का उपयोग कर clamping माउस कान त्वचा पर एक ischemia reperfusion-(आईआर) मॉडल की प्रेरण का वर्णन है। एक कस्टम निर्मित intravital इमेजिंग मॉडल का उपयोग करना, हम विवो भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के बाद reperfusion में अध्ययन करते हैं। इस तकनीक के विकास के पीछे तर्क कैसे ल्यूकोसाइट्स त्वचा आईआर चोट का जवाब की समझ का विस्तार करने के लिए है।
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Ischemia-reperfusion चोट (आईआरआई) तब होता है जब वहाँ रक्त प्रवाह (ischemia) ऊतकों (reperfusion) के एक बाद फिर से ऑक्सीजन के द्वारा पीछा की बाधा के कारण एक क्षणिक हाइपोक्सिया है। त्वचा में, ischemia reperfusion-(आईआर) दबाव अल्सर के pathophysiology, जहां लंबे समय तक बिस्तर पर आराम की चोट के लिए लंबी अवधि के अस्पताल में मरीजों predisposes के लिए योगदान कारकों में से एक माना जाता है। इन रोगियों में, दोनों त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशियों लगातार वजन बोनी प्रमुखता के क्षेत्रों के ऊपर लगाए गए दबाव को उजागर कर रहे हैं, स्थानीय चोटों कि, अगर अनुपचारित छोड़ दिया, परिगलित 1 हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप।
हर्जाना एक आईआरआई में शामिल दुगना कर रहे हैं। ischemia के दौरान, रक्त वाहिकाओं का रोड़ा ऊतकों को ऑक्सीजन वितरण की भारी गिरावट की ओर जाता है। इस एटीपी और पीएच, जो सेलुलर चयापचय में शामिल ATPases निष्क्रिय की कमी का परिणाम है। बदले में, सेलुलर कैल्शियम का स्तर स्पाइक, और जोर दिया है या क्षतिग्रस्त गएल apoptosis या परिगलन 2 से गुजरना। Intracellular सामग्री या क्षति जुड़े आणविक पैटर्न (नम) की रिहाई, HMGB1 की तरह, भड़काऊ प्रतिक्रिया से 3 योगदान देता है। दूसरी अपमान reperfusion के दौरान होता है। ऑक्सीजन और पीएच स्तर reperfusion के दौरान बहाल कर रहे हैं हालांकि, इस प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी (आरओएस), जो intracellular लिपिड, डीएनए और प्रोटीन के ऑक्सीकरण की ओर जाता है में परिणाम है। नतीजतन, समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों सक्रिय कर रहे हैं, जो एक माध्यमिक भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि भड़काऊ साइट 2 के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती शामिल है बंद सेट। जबकि भड़काऊ प्रतिक्रिया करने के लिए अग्रणी जैव रासायनिक घटनाओं का झरना अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, प्रतिरक्षा सेल गतिविधियों के स्थानिक और लौकिक विनियमन अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं।
यहाँ, हम साधारण चुंबक का उपयोग कर clamping माउस कान त्वचा पर एक मजबूत आईआर मॉडल का वर्णन है। multiphoton intravital इमेजिंग (MP-IVM) के साथ मिलकर, हमइन विवो भड़काऊ प्रतिक्रियाओं है कि हो reperfusion की जगह लेता है के बाद अध्ययन करने के लिए एक मॉडल की स्थापना की। विकास और इस तकनीक के उपयोग के पीछे तर्क यह समझने के लिए कि कैसे दोनों मध्य और घुसपैठ की कोशिकाओं को वास्तविक समय में आईआर का जवाब कोशिश है।
त्वचा पार्श्व पर clamping तकनीक का उपयोग आईआर के मौजूदा मॉडलों, अत्यधिक आक्रामक हैं, क्योंकि वे त्वचा दिशा में स्टील प्लेट की शल्य आरोपण की आवश्यकता होती है, उन्हें प्रतिरक्षा अध्ययन के 4 के लिए कम-से-आदर्श बना रही है। इसी तरह की एक गैर-आक्रामक clamping तकनीक माउस त्वचा पार्श्व 5,6 में वर्णित किया गया है। हालांकि, इस पद्धति में intravital इमेजिंग घटक के समावेश के कारण, हम बजाय लक्षित आईआर साइट के रूप में कान त्वचा, चुना क्योंकि यह साँस लेने के कारण आंदोलनों में गतिरोध उत्पन्न और इमेजिंग 7.8 के दौरान स्थिरता प्रदान करता है। इसके अलावा, ल्युकोसैट सबसेट कि interstitium अवधि, कान त्वचा और त्वचा पार्श्व के बीच समान हैं, हालांकिसंख्या और अनुपात थोड़ा 9 भिन्न हो सकते हैं। इस प्रकार, कान त्वचा एक आदर्श इमेजिंग साइट का प्रतिनिधित्व करता है।
इसके अलावा, सबसे डेटा इन आईआरआई मॉडल से लिया गया स्थूल मूल्यांकन (अल्सर की ग्रेडिंग) और समापन बिंदु भड़काऊ संकेतक 10 का सूक्ष्म विश्लेषण करने के लिए सीमित कर रहे हैं। इस मॉडल का उपयोग करना, एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस की त्वचा में reperfusion के बाद neutrophils के सेलुलर प्रतिक्रिया के वास्तविक समय दृश्य सक्षम है। एक पहले प्रकाशित intravital इमेजिंग कान मॉडल अतिरिक्त संशोधनों (आंकड़े 1, 2) के साथ 8 उपयोग किया जाता है।
महत्व
आईआर त्वचा दबाव अल्सर के प्रमुख कारणों में से एक है। दबाव अल्सर के प्रारंभिक दौर (मैं और द्वितीय) मानव त्वचा की हालत का वर्णन (अंतर्निहित चमड़े के नीचे के ऊतकों और मांसपेशियों की तुलना म?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Mice strains | |||
Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
PBS | |||
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
Ultrapurified water | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
High vacuum grease | Dow Corning | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | |||
TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Coverslip holder | |||
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Imaging analysis software | |||
Imaris v8.1.2 | Bitplane |