全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
樹状細胞（DC）は、我々の免疫系の最も重要な特殊な抗原提示細胞です。未成熟DC（iDCを）は、皮膚または粘膜組織に存在し、侵入する病原体と対話するための最初の免疫細胞の間で、したがってあります。彼らは病原体検出、次のTおよびB細胞応答を活性化することができますので、DCは、先天性および適応免疫系1との間のブリッジを表します。さらに、それらは、IL-1β、IL-6、およびIL-12などのためのサイトカインの多量の分泌の前炎症性免疫応答に寄与する。 DCはまた、NK細胞を活性化および走化性によって感染部位に他の免疫細胞を引き付けます。
DCは、未成熟樹状細胞（iDCを）とその形態および機能に基づいて、成熟樹状細胞（mDCの）2に分けることができます。多くのパターン認識受容体（ 例えば、Toll様受容体、C型の1による外来抗原の認識後レクチン、または豊富に細胞表面に発現）受容体を補完する、iDCをは大きな変化を受け、成熟し始めます。この成熟過程の間に、抗原捕獲のための受容体はダウンレギュレートされ、抗原提示に必須の分子がアップレギュレートされている一方、3。成熟DCアップレギュレート主要組織適合遺伝子複合体の抗原提示およびTリンパ球の活性化に必須であるCD80およびCD86のようなIおよびII（MHC I及びII）、共刺激分子、。さらに、細胞表面上のケモカイン受容体CCR7の発現は、リンパ節への末梢組織からのDCの移動を可能にする、誘導されます。移行は、リンパ節4-6のケモカインリガンド19（CCL19 / MIP-3B）およびケモカインリガンド21（CCL21 / SLC）の勾配に沿ってDCの「ローリング」によって促進されます。
移行後、mDCのは、このように、INI、CD4 +およびCD8 + T細胞をナイーブために処理抗原を提示します侵入病原体7に対する適応免疫応答をtiating。リンパ節におけるT細胞とのこの相互作用は、ウイルス8の広がりに関連しています。他のインビトロの研究では、DCが効率的に捕捉し、活発な感染9-12にこの送信結果T細胞へとすることをHIVを移すことを明らかにしました。これらの実験は、リンパ節への周囲からのシャトルバスとしてそのin vivoでの HIVの悪用のDCを強調表示します。抗原提示の間、DCは、エフェクターTヘルパー細胞の分化を形成し、したがって、微生物に対する全免疫応答の結果は、この非常に相互作用で決定されたキーのインターロイキンを分泌します。別にタイプ1（のTh1）および2型（Th2の）エフェクターT細胞、CD4 + Tヘルパー細胞の他のサブセット（ 例えば、タイプ17（Th17細胞）およびタイプ22（TH22）T細胞）が記載されており、それらの誘導から、および機能は徹底的に研究されてきました。 DCはさらに、に関与しています制御性T細胞（Treg）13,14の世代。これらの細胞は免疫抑制性であり、停止または誘導またはエフェクターT細胞の増殖をダウンレギュレートし、従って免疫寛容を開発するために重要であることができます。
人間従来のDC（のCDC）は、骨髄起源（ すなわち、ランゲルハンス細胞（LCS）と皮膚との間質のDC）またはリンパ系起源（ すなわち、形質のDC（pDCに））を用いた細胞のいくつかのサブセットを含みます。 インビトロ実験またはDCワクチン接種戦略は、単球由来のDCは、日常的に、皮膚のDCのモデルとして使用されています。これらの細胞は、従来の骨髄樹状細胞への生理、形態学、および機能の類似性を示します。これらは、健康なドナー12,15-18から単離された単球のインターロイキン4（IL-4）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を添加することによって生成されます。樹状細胞は、直接、皮膚または粘膜生検から単離することができる、またはできても、Beは子宮外を得た臍帯血サンプルから単離したCD34 +造血前駆細胞から開発します。ここでは、単球を単離し、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（PBMC）、濃縮した後、抗凝固処理ヒト血液から刺激される方法を示しています。 5日間インキュベートした後、特定の条件下でヒト単球は、iDCをに分化され、非臨床設定において実験手順の準備ができています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、磁性ナノ粒子ベースのアッセイを用いて抗凝固血液からヒト単球の単離を通して単球由来樹状細胞（MDDCs）の生成を説明しています。このプロトコルでは、遠心分離工程は、PBMC画分の濃縮につながる細胞単離手順、上流で行われます。細胞を遠心分離中に失われているが、密度勾配媒体200〜300ミリリットル必要とする密度勾配媒体の全血パックの内容をオーバーレイし、?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
Referências
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