Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
Las células dendríticas (DC) son las más importantes células presentadoras de antígeno especializadas de nuestro sistema inmune. Inmaduros países en desarrollo (IDC) residen en la piel o en los tejidos de las mucosas y son, por tanto, una de las primeras células inmunes para interactuar con los patógenos invasores. DCs representan el puente entre el innato y el sistema inmune adaptativo 1, ya que pueden activar células T y B respuestas después de la detección de patógenos. Además, contribuyen a la respuesta inmune pro-inflamatorias, debido a la secreción de grandes cantidades de citoquinas, tales como IL-1β, IL-6, y IL-12. DCs también activar las células NK y atraer otras células inmunes en el sitio de la infección por quimiotaxis.
DCs se puede dividir en células inmaduras dendríticas (IDC) y células dendríticas maduras (PMD) 2 en función de su morfología y función. Tras el reconocimiento de antígenos extraños por uno de los muchos receptores de reconocimiento de patrones (por ejemplo, los receptores tipo toll, de tipo Clectinas, o receptores del complemento) abundantemente expresado en la superficie celular, SIRD sufren cambios importantes y empiezan a madurar. Durante este proceso de maduración, los receptores de captura de antígeno están regulados hacia abajo, mientras que las moléculas esenciales para la presentación de antígenos son regulados hasta 3. DC maduras hasta de regular los principales complejos de histocompatibilidad I y II (MHC I y II), las moléculas co-estimuladoras como CD80 y CD86, que son esenciales para la presentación del antígeno y la activación de los linfocitos T. Además, se induce la expresión de receptores de quimioquinas CCR7 en la superficie celular, que permite la migración de los DC de los tejidos periféricos a los ganglios linfáticos. La migración se facilita por el "balanceo" de las DC a lo largo de un ligando de quimiocina 19 (CCL19 / MIP-3b) y el gradiente de ligando de quimiocina 21 (CCL21 / SLC) a los ganglios linfáticos 4-6.
Después de la migración, mDCs presentan el antígeno procesado a Naïve células CD4 + y CD8 +, por lo tanto ininego- una respuesta inmunitaria adaptativa contra el patógeno invasor 7. Esta interacción con las células T en los ganglios linfáticos también se asocia con la propagación del virus 8. Otros estudios in vitro revelaron que DCs captura y transferencia del VIH a las células T y que este resultado de la transmisión en una infección vigorosa 9-12 eficiente. Estos experimentos ponen de manifiesto que en vivo explota a los países en desarrollo VIH como un servicio de transporte desde la periferia hacia los ganglios linfáticos. Durante la presentación del antígeno, las DC secretan interleuquinas clave que dan forma a la diferenciación de las células efectoras T helper, y por lo tanto, el resultado de toda la respuesta inmune contra el microbio se determina en este mismo interacción. Además de tipo 1 (Th1) y de tipo 2 (Th2) T efectoras, otros subconjuntos de células T CD4 + helper (por ejemplo, tipo 17 (Th17) y tipo 22 (células Th22) T) se han descrito, y su inducción y la función se han investigado a fondo. DCs están implicados además enla generación de células T reguladoras (Tregs) 13,14. Estas células son inmunosupresores y pueden detener o regular a la baja la inducción o la proliferación de las células T efectoras y son por tanto cruciales para el desarrollo de la inmunidad y la tolerancia.
DC convencionales Humanos (CDC) comprenden varios subconjuntos de células con un origen mieloide (es decir, células de Langerhans (CL) y dérmica y las CD intersticiales) o un origen linfoide (es decir, países pt desarrollo plasmocitoide (PDC)). Para los experimentos in vitro o estrategias de vacunación DC, DCs derivadas de monocitos se utilizan habitualmente como modelo para DCs dérmicos. Estas células muestran similitudes en la fisiología, la morfología y la función a las células dendríticas mieloides convencionales. Se generan por la adición de interleucina 4 (IL-4) y de granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF) a monocitos aislados de donantes sanos 12,15-18. Las células dendríticas también pueden ser directamente aisladas de biopsias dérmicas o de las mucosas, o puede incluso be desarrolló a partir de células progenitoras hematopoyéticas aisladas de muestras de sangre de cordón umbilical obtenidas fuera del útero CD34 +. Aquí, demostramos cómo se aíslan y se estimularon a partir de sangre humana anti-coagulada después de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de enriquecimiento por centrifugación en gradiente de densidad de monocitos. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos bajo condiciones específicas se diferencian en SIRD y están listos para los procedimientos experimentales en un entorno no clínico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) a través del aislamiento de los monocitos humanos de sangre anticoagulada utilizando un ensayo basado en nanopartícula magnética. En este protocolo, las etapas de centrifugación se llevan a cabo aguas arriba del procedimiento de aislamiento de células, lo que conduce a un enriquecimiento de la fracción de PBMC. Aunque las células se pierden durante la centrifugación, para superponer el contenido de una bolsa de sangre …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
Referências
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