Protocol
1. Подготовка на основе пептидов рецептур
- Подготовка исходных растворов каждого пептида следующим образом : (КН) 9 -BP100 (1 мг / мл или 800 нМ), Cytcox- (КН) 9 (1 мг / мл), BP100 (1 мг / мл) и (BP100) 2 К 8 (70 мкМ). Взвешивают необходимое количество каждого пептида в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавьте автоклавированы сверхчистой воды для растворения пептида. Хорошо перемешайте повторным пипетированием до тех пор, пока не будет получен прозрачный раствор.
- Усиливаются и очищают плазмиды ДНК (плазмидной), двухцепочечной ДНК (дц) и двухцепочечной РНК (дцРНК) в соответствии со стандартными методиками молекулярных. В 1,5 мл микропробирок, делают маточные растворы с концентрацией 1 мг / мл (PDNA и дцДНК) или 400 нм (дцРНК).
- Подготовка белка маточного раствора с концентрацией 7 мкМ, растворением 1 мг белка (например., Алкогольдегидрогеназы, АДГ) порошка в 1 мл раствора карбоната натрия (0,1 М, рН 9). Добавьте белок с Fluorescent зонды, такие как родамина В (RhB) в соответствии со стандартными протоколами, с тем чтобы микроскопическую визуализацию белка, доставляемые в клетки.
- Объединяют соответствующие компоненты в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
- Для получения пептида-PDNA рецептуры нацеливание цитоплазму, добавьте 6,4 мкл (KH) 9 -BP100 (1 мг / мл) до 20 мкл плазмидной (1 мг / мл) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавить 773,6 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл. Используйте пДНК конструкцию , предназначенный для ядерной экспрессии (P35S-RLuc-TNOs, таблица 1).
- Для получения пептида-PDNA Препараты нацеливание митохондрии, добавляют 6,6 мкл Cytcox- (KH) 9 (1 мг / мл) до 20 мкл плазмидной (1 мг / мл) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° С и затем добавляют 2,4 мкл BP100 (1 мг / мл). Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при температуре 256; С в течение еще 15 мин. Добавить 771 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл. Используйте пДНК конструкцию , предназначенный для митохондриальной выражения (pDONR-COX2: rluc, таблица 1).
- Для составов пептид-дцДНК, добавляют 5,1 мкл (KH) 9 -BP100 (1 мг / мл) до 8 мкл двухцепочечной ДНК (1 мг / мл) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавить 786,9 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл.
- Для составов пептид-дцРНК, добавляют 50 мкл (KH) 9 -BP100 (800 нм) до 50 мкл дцРНК (400 нМ) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавьте 700 мкл РНКазы воды, чтобы разбавить раствор до конечного объема 800 мкл.
- Для составов пептид-белок, добавить 16 мкл (BP100) 2 K 8 (70 мкМ) до 16 мкл АДГ (7 мкм) и смешатьхорошо пипеткой. Дайте смеси для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C. Добавить 768 мкл автоклавного сверхчистой воды для разбавления раствора до конечного объема 800 мкл.
- Разрешить Препараты для стабилизации в течение 15 мин при 25 ° C.
2. Характеристика основе пептидов рецептур
- Передача каждого раствора (800 мкл) в кювету для динамического рассеяния света (DLS) анализа. Определить индекс гидродинамический диаметр и полидисперсности образованных комплексов с дзета Nanosizer, используя 633 нм He-Ne-лазера при 25 ° С с углом обнаружения обратного рассеяния 173 °.
- После измерения размера, передача каждого раствора (800 мкл) в сложенное капиллярной ячейки для измерения дзета-потенциала на параметры по умолчанию диэлектрической проницаемости, показатель преломления и вязкость воды при 25 ° С.
- Обратите внимание небольшой объем раствора комплекса, используемого для анализа DLS, методом атомно-силовой микроскопии (AFM). Депозит 10 мкл раствора комплекса на свеже открытой поверхности скола слюды листа и оставить слюду высохнуть на воздухе в течение ночи в закрытой пластиковой чашке Петри.
- Получения изображения комплексов в воздухе при 25 ° С с использованием кремниевого кантилевера с пружинной константой 1,3 Н / м в режиме 27,28 нарезание резьбы.
3. Проникновение листьев растений
- Используйте 3 - недельных почвы выращенных растений (Резуховидка Таля 24, Nicotiana benthamiana 24 или тополь 26). Трансфекцию по крайней мере 3 листьев, чтобы служить в качестве трех экземплярах для количественного определения экспрессии гена или белка доставки.
- Нагрузка 1 мл безыгольного пластиковый шприц с 100 мкл раствора комплекса для трансфекции одного листа. Поместите кончик шприца на абаксиальной поверхности листа.
- Нажмите наконечник шприца против листа слегка и нажмите на поршень шприца медленно в то время оказывая встречное давление с INDEX палец латексной перчатке с противоположной стороны. Успешное инфильтрации можно наблюдать, как растекание воды пропитанной области в листе. Этикетка проникших листья для облегчения идентификации.
- Выдержите трансфи- лист для оптимизированных длительностей следующие инфильтрации с пептидом-пДНК (12 ч), пептид-дц (12 ч), пептид-дсРНК - рецептур (9 48 ч) и пептид-белок (6 ч) при следующих условиях: 16 ч света / 8 ч темноты при 22 ° С для А. thaliana и тополя, или 24 ч постоянного света при 29 ° С для N. benthamiana.
4. Оценка эффективности трансфекции
- Акцизный весь трансфи- лист мелких растений (например., A. thaliana) или раздел 1 см 2 инфильтрированного области для более крупных растений (например., Н. benthamiana).
- Для экспериментов с трансфекцией с использованием Renilla люциферазы (Rluc) репортер вектор, определить transfectioп эффективность количественно с использованием набора Rluc анализа.
- Поместите каждую вырезанную лист или лист в секцию трубки микроцентрифужных 1,5 мл. Добавьте 100 мкл 1 × Rluc пробирной лизирующего буфера на пробирку. Таким же образом, готовить лизаты не-трансфецировали листьев контрольных (в трех повторах).
- Измельчите лист, используя гомогенизацию пестиком и инкубировать результирующую лизат при температуре 25 ° С в течение 6 - 10 ч.
- Центрифуга лизат при 12,470 × г в микроцентрифуге в течение 1 мин. Передача 20 мкл очищенного лизата в лунку в 96-луночный микропланшет, а также использовать оставшийся объем для количественного определения общей концентрации белка с использованием набора для анализа BCA Protein в соответствии с протоколом производителя.
- Добавьте 100 мкл 1 × Rluc пробирной субстрата (разводили с использованием Rluc буфером для анализа) в скважину и перемешать с помощью медленного пипеткой. Поместите планшет в планшет-ридере многомодового и начать измерение.
- Вычтите фоновое свечение (среднее значение такого нетн-трансфицировали трех экземплярах) от люминесценции каждого экспериментального образца. Рассчитать отношение фотолюминесценции (относительных световых единицах, RLU) на количество белка (мг).
- Для экспериментов с трансфекцией с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) репортер вектора или флуоресцентно меченого белка (например., АДГ-RhB), наблюдать флуоресценцию с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
- Обрежьте края целого листа (для облегчения удаления воздушных прослоек), в то время как секционная лист может быть использован как таковой. Извлекают поршень из шприца 10 мл и поместить каждую вырезанную листьев или листьев участок в шприце.
- Заменить плунжер и толкать его осторожно на дно шприца без дробления листа. Draw воду в шприц до тех пор, пока не будет приблизительно наполовину заполнена.
- Направить шприц вверх и нажать на поршень, чтобы удалить воздух из шприца через наконечник. Накройте кончик шприца и потяните поршень вниз медленно, чтобы удалить воздух из LEAе. Повторите эту процедуру несколько раз, пока лист не появится полупрозрачная.
- Покройте поверхность предметного стекла микроскопа с помощью клейкой ленты. Вырежьте квадратную область на ленте достаточно большой, чтобы вместить образец листа с помощью ножа, и кожура квадратный кусок ленты от пинцетом, чтобы создать образец камеры. Лента будет служить в качестве прокладки между предметным и покровным.
- Поместите лист в камере с абаксиальной поверхностью, обращенной вверх, и заполнить оставшуюся площадь камеры с водой. Печать листа внутри камеры с покровным стеклом и закрепить края покровного стекла с помощью клейкой ленты.
- Осмотрите образец листа с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии под объективом 40х или иммерсионный объектив 63X воды. GFP или RhB флуоресценции могут быть визуализированы при возбуждении длины волны 488 нм или 555 нм, соответственно.
Representative Results
Массив кислот и белков грузов нуклеиновых были успешно внедрены в различных растений с использованием разработанных пептидов в качестве векторов доставки. Электростатическое взаимодействие между катионными пептидами и отрицательно заряженных грузов привело к образованию комплексов трансфекции , которые могут быть непосредственно инфильтрации в листьях растений с помощью безыгольного шприца (Рисунок 1). Оптимизированные рецептуры (эмпирически определенные в этих исследованиях 21,23-26) для трансфекции клеток растений, перечислены в таблице 1, где представлен каждый тип широкого спектра поставляемых грузов (пДНК, дцДНК, дцРНК и белок). Средние диаметры всех пептидных на основе рецептур в диапазоне приблизительно от 150 - 300 нм. На основе анализа DLS, все составы показаны относительно низкие полидисперсность размера, что указывает, что агрегаты, образованные пептид-грузовой имеют равномерное распределение по размерам. Морфологиякомплексов между пептидом и пДНК (Рисунок 2А) или белка (рис 2В), на слюду, были обследованы с помощью атомно - силовой микроскопии. Однородные шаровидные комплексы наблюдались для обоих пептидных-пДНК и пептид-белковых комбинаций, в согласии с данными измерений DLS. С точки зрения дзета - потенциала комплексов (таблица 1), pDNA- и дц-полученные комплексы были чистые заряды отрицательной поверхности в то время как дсРНК на основе комплексов была почти нейтральной поверхностный заряд. Пептид-белковых комплексов, с другой стороны, были положительно заряженными.
Эффективности пептид-пДНК и рецептур пептид-дцДНК в опосредовании трансфекцию A. thaliana или N. benthamiana в качестве модельных систем растений оценивали количественно, а также качественно. Экспрессия гена анализа RLuc использовали для количественной оценки уровней экспрессии генов (таблица 1), поэтому для этого эксперимента плазмидной илидц, кодирующий ген RLuc должен быть использован для комплексообразования с соответствующими пептидами-носителями. Используя (KH) 9 -BP100 / рецептура пДНК, ядерно-направленной доставки и экспрессии плазмидной может быть достигнуто, после инкубационного периода продолжительностью в 12 часов, с предполагаемой RLU / мг значения приблизительно 1 × 10 5. Для митохондриальной-направленной доставки и экспрессии плазмидной, сочетание пептидов, Cytcox- (KH) 9 и BP100, требуется для образования комплекса. С тем же самым оптимизированным инкубационного периода в 12 часов, однако, намного более низкий уровень трансфекции (примерно 1 × 10 3 о.е. / мг) была достигнута. В то же время, требовалось подобное Инкубационный период (12 ч) и уровень экспрессии гена (приблизительно 1 × 10 3 RLU / мг) / регистрируются для комплексов дц на основе, а также сформулированы с использованием (KH) 9 -BP100 пептида. Качественные оценки экспрессии генов проводили путем прямого микроскопического наблюдения листьев, обработанных комплексов ДГОред использованием пДНК или дц, кодирующий ген GFP-репортер. В клетках , трансфицированных нецелевых пептид-пДНК комплексов, диффузный зеленую флуоресценцию , соответствующую экспрессию GFP отчетливо наблюдалась и нашел для локализации в цитоплазме (рис 3А). Четкие различия в характере локализации флуоресценции GFP были очевидны в клетках, внедренных с митохондриальных-мишенью пептид-пДНК комплексов. Здесь, точечное зеленая флуоресценция , которая локализуется с митохондриальной пятно было видно, что подтверждает специфичность экспрессии генов исключительно в митохондриальной отделении клеток (фиг.3В).
В случае препаратов пептид-белок, конъюгирование белка груза (АДГ) до флуорофор (RhB) позволит получать визуализацию поставляемого белка в внутриклеточное. В течение короткого инкубационного периода от 6 ч, был обнаружен белок АДГ-RhB (синий), которые будут распределены по всемуцитозоль и вакуоли проникших клеток (рис 3C). В то же время, быстрое и эффективное понижающая регуляция экспрессии генов может быть достигнуто в различных растениях с использованием составов пептид-дцРНК. В первом эксперименте, А. thaliana листьев пропитывали с пептидной-дсРНК комплексов , чтобы заставить замолчать ген халкон - синтазы (CHS) , ответственные за антоцианов (красный пигмент) биосинтеза в условиях засухи. Разница во внешности A. thaliana листьев при нормальных условиях (рис 3D, а) и засухи (рис 3D, б) при условии легкое средство для оценки CHS заглушающие с использованием оптимизированной рецептурой пептид-дсРНК (стрелка 1 указывает на пропитанную область). Во втором эксперименте, пептид-дцРНК комплексы проникали в листьях трансгенного A. thaliana , экспрессирующих желтого флуоресцентного белка (YFP). Явное снижение экспрессии YFP можно было увидеть в клетках эпидермиса 9 ч рОСТ-трансфекцию (рис 3E, F). Эффективность препарата в экспрессии гена понижающего регулирования в другой системе растений (тополь, 12 ч после трансфекции) была также проверена (рис 3G, H).
Рисунок 1: Пептид основе Препараты для доставки нуклеиновых кислот и белков грузам в живых растений.
Разработанные пептиды-носители состоят из поликатионов, конъюгированных с клеточной проникающего или органелл последовательностей транзита. Поликатионы дают возможность связывания и / или конденсация отрицательно заряженных грузов, а также побег из эндосомный отсека следующие интернализации в клетки. Доставка грузов в клетки, а затем в специфических органеллах опосредуется клеток проникающего последовательностей и последовательностей органелл транзита, соответственно. Различные грузы, которые могут быть successfuLLY доставлены в растение включают нуклеиновые кислоты, такие как пДНК, дцДНК и дцРНК, а также модельные белки, такие как бычий сывороточный альбумин (БСА), алкогольдегидрогеназы (АДГ) и цитрин (вариант желтого флуоресцентного белка). Биоактивные молекулы способны образовывать комплексы с трансфекцию пептидных конъюгатов через электростатических взаимодействий, которые вводятся в листьях растений с помощью шприца инфильтрации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Морфология основе пептидов Рецептуры.
(A) AFM амплитуда изображения (KH) 9 -BP100 композиции / пДНК при N / P 0,5. (B) Высота AFM изображение (BP100) 2 K 8 / препарата АДГ при молярном ратиO 10. Воспроизводится с разрешения из опубликованных источников 23,24. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: микроскопическая оценка трансфекционного Efficiencies с оптимизированной пептидной основе рецептур.
(А) выражение цитозольного GFP (зеленый), четко отличать от хлоропластов автофлюоресценции (красный), наблюдалось в губчатой мезофильных клетках A. thaliana листьев инфильтрации (KH) 9 композиции -BP100 / пДНК (N / P 0,5; 12 ч ). (B) выражение GFP (зеленый) был обнаружен в митохондриях (красный) в эпидермальных клетках A. thaliana листьев инфильтрации Cytcox- (KH) 9 / BP100 композиции / пДНК (N / P 0,5 для каждого пептиде; 12 ч). Увеличенные изображения митохондрий с выражением GFP показаны в крайнем правом панели. (С) Поставка ADH-RHB (синий) в губчатую мезофильных клетках A. thaliana листьев опосредована (BP100) 2 К 8 при мольном соотношении пептид / белок , 10, визуализируются 6 ч после инфильтрации. (D) A. thaliana листьев до (а) и после (б) обработки (KH) 9 -BP100 / препарат дсРНК (мольное отношение 2; 48 ч), что привело к подавлению биосинтеза антоцианов. Аналогичный препарат , содержащий GFP5 дсРНК пропитывали в лист в качестве отрицательного контроля (с). Стрелки 1 и 3 показывают инфильтрированного область в то время как стрелки 2 и 4 указывают на не-инфильтрированного область внутри листа. (Е) А. thaliana листьев выражения желтого флуоресцентного белка (YFP) и (F) Уменьшенный YFP флуоресценции следующую инфильтрации (КН) 9 -BP100 / дсРНК рецептура (мольное отношение 2; 9 ч). (G) Трансгенные листьев тополя , выражающие желтый флуоресцентный белок (YFP) и (H) уменьшенная YFP флуоресценции следуя инфильтрация (KH) 9 -BP100 / дсРНК формулировка (мольное отношение 2, 12 ч). Воспроизводится с разрешения из опубликованных источников 21,23,24,26. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Изменение пептидом-к-ДНК (N / P) Соотношение и влияние на биофизические свойства комплексов.
С увеличением пептида с соотношением ДНК, составы на основе пептидов уменьшаются в размерах в то время как их дзета-потенциал значений перехода от отрицательного к положительному./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Характеристика и оценка различных композиций на основе пептидов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Таблица 2: Сравнение на основе пептидов и других существующих технологий ДНК для доставки интактных растений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Discussion
Критические шаги в рамках протокола, которые были определены эмпирически обсуждаются. С помощью шприца инфильтрации, препараты на основе пептидов, вводятся в воздушном пространстве внутри листа растения через устьица. Для того, чтобы обеспечить максимальное поглощение раствора, процесс инфильтрации следует проводить , когда растения в условиях, которые способствуют устьичным открытию то есть., При условии , с достаточным количеством воды и в течение светового периода. Что касается подготовки трансфекцию комплексов, для составов, которые включают комбинацию двух пептидов (для доставки ДНК митохондриальной-мишенью), последовательность для добавления каждого компонента имеет решающее значение и не должна быть перевернутой.
Есть много правдоподобных изменения в процедуре. Еще один вариант для инфильтрации клеток растений является использование вакуумной пропитки, которая способна ввести комплексное решение в целые растения и / или частичной тканей, включаяапикальные меристемы. Для этой альтернативной процедуры, рассаду погружают в раствор для трансфекции, а также на основании давления, создаваемого вакуума, пептид-грузовые комплексы вынуждены через устьица и в клетках растений (Yoshizumi, T., неопубликованные данные).
Кратковременная экспрессия гена, основанный на исследованиях с использованием животных клеток, было показано , что увеличение с более высокими концентрациями ДНК 29-31. Важно отметить , что отношение пептида к ДНК влияет на биофизические свойства (размер, поверхность заменяющим ) комплексов (рис 4), который влияет на эффективность трансфекции; следовательно, оптимальное соотношение должно поддерживаться даже с повышенной концентрацией ДНК.
Одним из главных преимуществ в использовании пептидов, как ген / белок агента доставки является то, что его последовательность поддается настройке для выполнения требуемой функции. Например, митохондриальная-направляющий домен пептида-носителя описано в данном шпилькеу может быть заменен хлорпластического или пероксисом нацеливания последовательностей для локализации этих органелл. В то время как трансформация хлоропластов возможно в нескольких растений с использованием биолистики 32-34, ни Agrobacterium , ни биолистической метод может ввести гены в митохондрии или других органеллах , помимо ядра (таблица 2).
Там нет жестких ограничений хост-диапазона для пептидной основе трансфекции, в отличие от метода Agrobacterium -На (таблица 2). До сих пор, составы для трансфекции A. thaliana, Н. benthamiana и тополя были оптимизированы (таблица 1), но метод может быть применен для Nicotiana аЬасит, томатный сорт Микро-Том, рис (на основе предварительных экспериментов), и другие моно- и двудольных растений.
Пока еще не существует известное ограничение размера трансгена, когда пептиды используютs трансфекции векторов. В противоположность этому , большие молекулы ДНК было обнаружено, что снижает эффективность трансформации Agrobacterium опосредованной методов 35,36, а верхний предел размера для трансгенов приблизительно 200 кб было сообщено 37-39. Использование биолистики, с другой стороны, большие ДНК - фрагменты могут быть стриженый во время приготовления или доставки в растения 38. Хотя верхний предел не был определен для баллистической трансформации до сих пор, физические сдерживает были найдены , чтобы ограничить размер ДНК , которые могут быть переданы намного меньше , чем 150 кб 40. Основные преимущества использования системы на основе пептидов для переноса генов по сравнению с существующими подходами по принципу либо Agrobacterium или бомбардировки микрочастицами, рассмотренных выше, приведены в таблице 2.
существует несколько ограничений для этого метода в его нынешнем виде. Во-первых, направленную доставку пДНК к конкретным органелл, таких как МИТochondria, было доказано, возможно, с помощью простого сочетания ДНК-связывающих клеток, проникающих и органелл транзитных последовательностей хотя эффективность была низкой. экспрессии трансгена может быть обнаружена, с помощью конфокальной микроскопии, только в небольшой популяции митохондрий в клетках. Следовательно, дальнейшие модификации необходимы для: (I) повышения транслокацию более комплексов через клеточную / органоидного мембраны, и (II), улучшение диссоциации и передачи пДНК от пептида-носителя в целевую органеллы для экспрессии. Во-вторых, с помощью этой системы доставки ДНК, временной экспрессии экзогенных генов репортер был успешно достигнут в цитозольной и митохондриальной отделении клеток. Стабильное включение и экспрессия введенных генов в растении ядерном / органоидного генома еще не были установлены, однако, из-за отсутствия подходящих стратегий отбора.
Признавая, что есть области для улучшения или дальнейшего гАЗВИТИЕ, стратегия пептид, полученных описанным здесь остается простой и универсальный метод, который проложил путь для доставки различных грузов в различных видах растений.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить финансирование из Японии науки и технологии агентства Поисковое исследование перспективных технологий (JST-ERATO), в новых энергетических и промышленных технологий развития организации (NEDO), а также стратегической программы продвижения инноваций межведомственный (SIP), Япония ,
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
| (BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
| BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
| Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
| P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
| pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
| dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
| GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| 1 ml and 10 ml Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
| 96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
| Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
| Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
| Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
| Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
| Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
| Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
| Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
| Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
| Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
| Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
| Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
| Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
| Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
| Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
| Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
| Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
| Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
| Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
| Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
| Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
| Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |
References
- Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
- Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
- Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
- Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
- Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
- Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
- Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
- Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
- Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
- Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
- Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
- Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
- Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
- Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
- Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
- Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751 (2015).
- Plant transformation method. Patent. Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. , WO2015133652 A1 (2015).
- Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).
- Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
- Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
- Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
- Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
- Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
- Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
- Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
- Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P.
- Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
- Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
- Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
- Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).
- Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
- Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).
