Regards sur les interactions des acides aminés et Peptides avec matériaux inorganiques à l'aide d'une seule molécule de travail Spectroscopy

Summary

Nous présentons ici un protocole pour mesurer la force des interactions entre une surface inorganique bien définie et soit des peptides ou des acides aminés par une seule molécule des mesures de spectroscopie de force au moyen d'un microscope à force atomique (AFM). Les informations obtenues à partir de la mesure est importante pour mieux comprendre le matériau interphase peptide-inorganique.

Abstract

Les interactions entre les protéines ou peptides et des matériaux inorganiques conduisent à plusieurs procédés intéressants. Par exemple, en combinant des protéines avec des minéraux conduit à la formation de matériaux composites ayant des propriétés uniques. En outre, le procédé de l'encrassement biologique indésirable est initiée par l'adsorption des molécules biologiques, principalement des protéines, sur les surfaces. Cette couche organique est une couche d'adhérence pour les bactéries et leur permet d'interagir avec la surface. Comprendre les forces fondamentales qui régissent les interactions à l'interface organique-inorganique est donc important pour de nombreux domaines de la recherche et pourrait conduire à la conception de nouveaux matériaux pour des applications optiques, mécaniques et biomédicales. Ce document démontre une technique de spectroscopie de force une seule molécule qui utilise un AFM pour mesurer la force d'adhérence entre soit des peptides ou des acides aminés et des surfaces inorganiques bien définies. Cette technique implique un protocole de fixation de la molécule biologique à l'AFMpointe à travers une liaison flexible covalente et une seule molécule des mesures de spectroscopie de force par microscope à force atomique. En outre, une analyse de ces mesures est inclus.

Introduction

L'interaction entre les protéines et les minéraux inorganiques conduit à la construction de matériaux composites ayant des propriétés particulières. Cela comprend des matériaux à haute résistance mécanique ou des propriétés optiques uniques. ^{1, 2,} par exemple, la combinaison de la protéine de collagène avec l'hydroxyapatite minérale génère soit des os mous ou durs pour les différentes fonctionnalités. ³ peptides courts peuvent également lier des matériaux inorganiques avec une grande spécificité. ^{4, 5, 6} La spécificité de ces peptides a été utilisé pour la conception de nouveaux matériaux magnétiques et électroniques, ^{7, 8, 9} fabrication des matériaux nanostructurés, croissance de cristaux, ¹⁰ et la synthèse de nanoparticules. ¹¹ Comprendre le mécanisme sous – jacent des interactions entre des peptides ou des protéines et des matières inorganiques va donc nous permettre de concevoir de nouveaux matériaux composites avec l' amélioration des propriétés d' adsorption. En outre, depuis l'interphase des implants avec une réponse immunitaire est médiée par des protéines, une meilleure compréhension des interactions des protéines avec des matériaux inorganiques permettra d'améliorer notre capacité à concevoir des implants. Un autre domaine important qui implique des protéines interagissant avec des surfaces inorganiques est la fabrication de matériaux anti-salissures. ^{12, 13, 14, 15} encrassement biologique indésirable est un processus dans lequel les organismes se fixent sur une surface. Il a de nombreuses conséquences néfastes sur nos vies. Par exemple, l'encrassement biologique des bactéries sur les dispositifs médicaux conduit à des infections nosocomiales. Biofouling des organismes marins sur les bateaux et les grands navires augmente la consommation de carburant. ^{12, 16, 17, 18}

Simple-molécule vigueur spectroscopie (SMFS), en utilisant un AFM, peut directement mesurer les interactions entre un acide aminé ou un peptide avec un substrat. ^{19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26} D' autres méthodes telles que l' exposition sur phage, ^{27, 28} microbalance à cristal de quartz (QCM) ²⁹ ou par résonance plasmonique de surface (SPR) ^{29, 30, 31, 32,}ref "> 33 mesure les interactions des peptides et des protéines à des surfaces minérales en vrac. ^{34, 35, 36} Cela signifie que les résultats obtenus par ces procédés se rapportent à des ensembles de molécules ou d'agrégats. Dans SMFS, un ou très peu de molécules sont fixées à la pointe de l'AFM et de leurs interactions avec le substrat désiré est mesurée. Cette approche peut être étendue à l'étude du repliement des protéines en tirant sur la protéine à partir de la surface. En outre, il peut être utilisé pour mesurer les interactions entre les cellules et les protéines et la liaison des anticorps à leurs ligands. ^{37, 38, 39, 40} Le présent document décrit en détail comment attacher soit des peptides ou des acides aminés à la pointe de l' AFM en utilisant la chimie de silanol. En outre, le document explique comment effectuer les mesures de force et de la façon d'analyser larésultats.

Protocol

1. Astuce Modification Achat de nitrure de silicium (Si 3 N 4) Les cantilevers AFM avec des pointes de silicium (Rayon cantilever nominal de ~ 2 nm). Nettoyez chaque cantilever AFM par trempage dans de l'éthanol anhydre pendant 20 min. Sec à température ambiante. Traiter ensuite les cantilevers en les exposant à plasma O 2 pendant 5 min. Suspendre les pointes propres ci-dessus (3 cm) un contenant méthyltriéthoxysilane de la solution et l'acide…

Representative Results

Figure 1 présente la procédure de modification de la pointe. Dans la première étape, un traitement au plasma modifie la surface de la pointe de nitrure de silicium. La pointe présente des groupes OH. Ces groupes seront ensuite réagir avec les silanes. A la fin de cette étape, la surface de la pointe sera couverte par les groupes -NH 2 libre. Ces amines libres vont alors réagir avec Fmoc-NHS -PEG, une liaison covalente. Le groupe Fmoc de l'agent de …

Discussion

Les étapes 1.3, 1.4 et 1.7 dans le protocole devrait être effectué avec soin complet et d'une manière très douce. A l'étape 1.3, l'embout ne doit pas être en contact avec le mélange à base de silane et le procédé de silanisation doit être effectuée dans une atmosphère inerte (eau libre). ⁴⁵ Ceci est fait dans le but d'empêcher la formation multicouche et parce que les molécules de silane subissent facilement l' hydrolyse en présence d'humidité. <sup class…

Materials

Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips	Bruker (Camarilo, CA, USA)		MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm
Methyltriethoxysilane	Acros Organics (New Jersey, USA)		For Silaylation of the AFM tip
3-(Aminopropyl) triethoxysilane	Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)		Used for tip modification
Triisopropylsilane	Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)		Used for tip modification
N-Ethyldiisopropylamine	Alfa-Aesar (Lancashire, UK)		Used for tip modification
Triethylamine	Alfa-Aesar (Lancashire, UK)		Used for tip modification
Piperidine	Alfa-Aesar (Lancashire, UK)		Used for tip modification
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide  (Fmoc-PEG-NHS)	Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)		Used as the covalent flexible linker  (MW = 5000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)	Alfa Aser (Heysham, England)		Used as a coupling reagent.
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)	Acros Organics (New Jersey, USA)		Used as Solvent in Tip modification procedure
DMF (dimethylformamide)	Merck (Darmstadt, Germany)		Used as Solvent in Tip modification procedure
Trifluoro acetic acid (TFA)	Merck (Darmstadt, Germany)
Acetic anhydride	Merck (Darmstadt, Germany)
Peptides	GL Biochem (Shanghai, China).
Phenylalanine and Tyrosine	Biochem (Darmstadt, Germany)
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)	Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)		(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)
Mica substrates	TED PELLA, INC. (Redding, California, USA)		9.9 mm diameter