Miradas en torno a las interacciones de los aminoácidos y péptidos con materiales inorgánicos Uso de una sola molécula de la Fuerza Espectroscopia
Summary
Aquí se presenta un protocolo para medir la fuerza de las interacciones entre una superficie inorgánica bien definido y, o bien péptidos o aminoácidos mediante medidas de espectroscopia de fuerza de una sola molécula usando un microscopio de fuerza atómica (AFM). La información obtenida de la medición es importante para entender mejor la interfase material peptídico-inorgánico.
Abstract
Las interacciones entre las proteínas o péptidos y materiales inorgánicos conducen a varios procesos interesantes. Por ejemplo, la combinación de proteínas con minerales conduce a la formación de materiales compuestos con propiedades únicas. Además, el proceso no deseable de contaminación biológica se inicia por la adsorción de biomoléculas, principalmente proteínas, en las superficies. Esta capa orgánica es una capa de adhesión para las bacterias y les permite interactuar con la superficie. La comprensión de las fuerzas fundamentales que gobiernan las interacciones en la interfaz orgánica-inorgánica tanto, es importante para muchas áreas de investigación y podría conducir al diseño de nuevos materiales para aplicaciones ópticas, mecánicas y biomédicas. Este artículo demuestra una técnica de espectroscopia de fuerza de una sola molécula que utiliza un AFM para medir la fuerza de adhesión entre cualquiera de los péptidos o aminoácidos y superficies inorgánicas bien definidos. Esta técnica implica un protocolo para la fijación de la biomolécula a la AFMinclinar a través de un enlazador flexible covalente y medidas de espectroscopia de fuerza de una sola molécula por microscopio de fuerza atómica. Además, se incluye un análisis de estas mediciones.
Introduction
La interacción entre las proteínas y los minerales inorgánicos conduce a la construcción de materiales compuestos con propiedades distintivas. Esto incluye materiales con alta resistencia mecánica o propiedades ópticas únicas. 1, 2 Por ejemplo, la combinación de la proteína colágeno con la hidroxiapatita mineral genera cualquiera de huesos blandos o duros para diferentes funcionalidades. 3 Los péptidos cortos también pueden unirse materiales inorgánicos con alta especificidad. 4, 5, 6 La especificidad de estos péptidos se ha utilizado para el diseño de nuevos materiales magnéticos y electrónicos, 7, 8, 9 la fabricación de materiales nanoestructurados, el crecimiento de cristales, 10 y sintetizar nanopartículas. 11 La comprensión del mecanismo subyacente a las interacciones entre las proteínas y péptidos o materiales inorgánicos, por tanto, nos permitirá diseñar nuevos materiales compuestos con mejores propiedades de adsorción. Además, puesto que la interfase de los implantes con una respuesta inmune está mediada por proteínas, una mejor comprensión de las interacciones de las proteínas con los materiales inorgánicos mejorará nuestra capacidad de diseñar implantes. Otra área importante que implica proteínas que interactúan con superficies inorgánicas es la fabricación de materiales antiincrustantes. 12, 13, 14, 15 de la contaminación biológica es un proceso no deseable en el que los organismos se adhieren a una superficie. Tiene muchas consecuencias perjudiciales en nuestras vidas. Por ejemplo, la contaminación biológica de las bacterias en los dispositivos médicos conduce a infecciones adquiridas en el hospital. La contaminación biológica de los organismos marinos en los barcos y buques de gran tamaño aumenta la el consumo de combustible. 12, 16, 17, 18
espectroscopia de fuerza Single-molécula (SMF), utilizando un AFM, se puede medir directamente las interacciones entre un aminoácido o un péptido con un sustrato. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Otros métodos como la presentación de fagos, 27, 28 microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) 29 o resonancia de plasmón superficial (SPR) 29, 30, 31, 32,ref "> 33 medida las interacciones de péptidos y proteínas a superficies inorgánicas a granel. 34, 35, 36 Esto significa que los resultados obtenidos por estos métodos se refieren a conjuntos de moléculas o agregados. En SMFS, una o muy pocas moléculas se fijan a la punta del AFM y sus interacciones con el sustrato deseado se mide. Este enfoque se puede ampliar para estudiar el plegamiento de proteínas tirando de la proteína de la superficie. Además, se puede utilizar para medir las interacciones entre las células y las proteínas y la unión de anticuerpos a sus ligandos. 37, 38, 39, 40 En este trabajo se describe en detalle cómo conectar cualquiera de los péptidos o aminoácidos a la punta del AFM utilizando la química de silanol. Además, el documento explica cómo realizar las mediciones de la fuerza y la forma de analizar laresultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos 1.3, 1.4 y 1.7 en el protocolo debería llevarse a cabo con gran cuidado y de una manera muy suave. En la etapa 1.3, la punta no debe estar en contacto con la mezcla de silano y el proceso de silanización debe llevarse a cabo en una atmósfera inerte (libre de humedad). 45 Esto se realiza con el fin de evitar la formación de múltiples capas y porque las moléculas de silano experimentan fácilmente hidrólisis en presencia de humedad. 45
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.
Materials
| Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm | |
| Methyltriethoxysilane | Acros Organics (New Jersey, USA) | For Silaylation of the AFM tip | |
| 3-(Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for tip modification | |
| Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for tip modification | |
| N-Ethyldiisopropylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Triethylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Piperidine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS) | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) | Used as the covalent flexible linker (MW = 5000 Da) | |
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, England) | Used as a coupling reagent. | |
| N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) | Acros Organics (New Jersey, USA) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| DMF (dimethylformamide) | Merck (Darmstadt, Germany) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Trifluoro acetic acid (TFA) | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Acetic anhydride | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Peptides | GL Biochem (Shanghai, China). | ||
| Phenylalanine and Tyrosine | Biochem (Darmstadt, Germany) | ||
| 30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) | (30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | |
| Mica substrates | TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) | 9.9 mm diameter |
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