Innsikt i de Samhandling av aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Bruke Single-Molecule Force spektroskopi

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å måle kraften av interaksjoner mellom en veldefinert uorganisk overflate og enten peptider eller aminosyrer ved én-molekyl kraft spektroskopi-målinger ved hjelp av en atommikroskop (AFM). Oppnådd fra målingen informasjonen er viktig for bedre å forstå den peptid-uorganisk materiale interfase.

Abstract

Interaksjonene mellom proteiner eller peptider og uorganiske materialer fører til flere interessante prosesser. For eksempel, ved å kombinere proteiner med mineraler fører til dannelse av komposittmaterialer med spesielle egenskaper. I tillegg er det uønskede fremgangs biobegroing initiert ved adsorpsjon av biomolekyler, hovedsakelig proteiner, på overflater. Det organiske laget er et klebesjikt for bakterier og gjør det mulig for dem å kommunisere med overflaten. Forstå de grunnleggende kreftene som styrer samhandlingen på organisk-uorganisk grensesnitt er derfor viktig for mange forskningsområder og kan føre til utformingen av nye materialer for optiske, mekaniske og biomedisinske applikasjoner. Dette papir viser en enkelt-molekyl kraft spektroskopi teknikk som benytter en AFM for å måle adhesjonskraften mellom enten peptider eller aminosyrer og veldefinerte uorganiske overflater. Denne teknikk innebærer en protokoll for å feste biomolekyl til AFMtips gjennom en kovalent fleksibel linker og single-molekyl kraft spektroskopi målinger av atommikroskop. I tillegg er en analyse av disse målingene er inkludert.

Introduction

Samspillet mellom proteiner og uorganiske mineraler fører til bygging av komposittmaterialer med karakteristiske egenskaper. Dette inkluderer materialer med høy mekanisk styrke eller spesielle optiske egenskaper. ^{1, 2} kan for eksempel kombinasjonen av proteinet collagen med mineral hydroksyapatitt genererer enten bløte eller harde bein for forskjellige funksjoner. ³ korte peptider kan også binde uorganiske materialer med høy spesifisitet. ^4, og ^{5, 6} Spesifisiteten av disse peptidene er brukt for å designe nye magnetiske og elektroniske materialer, ^{7, 8, 9} tilvirkning av nanostrukturerte materialer, vokser krystaller, ¹⁰ og syntetisere nanopartikler. ¹¹ Forstå mekanismen bak interaksjoner mellom peptider eller proteiner og uorganiske materialer vil derfor tillate oss å designe nye komposittmaterialer med forbedrede adsorberende egenskaper. I tillegg, siden den interfase av implantater med en immunrespons blir mediert av proteiner, bedre forståelse interaksjonene mellom proteiner med uorganiske materialer som vil forbedre evnen til å utforme implantater. Et annet viktig område som innebærer proteiner i samspill med uorganiske overflater er fabrikasjon av bunnstoff materialer. ^{12, 13, 14,} er ¹⁵ Begroing en uønsket prosess hvor organismene fester seg til en overflate. Det har mange uheldige konsekvenser for våre liv. For eksempel, begroing av bakterier på medisinsk utstyr fører til sykehusinfeksjoner. Begroing av marine organismer på båter og store skip øker forbruk av drivstoff. ^{12, 16, 17, 18}

Enkelt-molekyl kraft spektroskopi (SMFS), ved hjelp av en AFM, kan direkte måle interaksjonen mellom en aminosyre eller et peptid med et substrat. ^{19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26} Andre metoder så som fag-display, ^{27, 28} kvartskrystall mikrovekt (QCM) ²⁹ eller overflate-plasmonresonans (SPR) ^{29, 30, 31, 32,}ref "> 33 mål interaksjoner av peptider og proteiner til uorganiske overflater i bulk. ^{34, 35, 36} Dette betyr at de resultater som oppnås ved disse metodene er knyttet til ensembler av molekyler eller aggregater. I SMFS, er en eller svært få molekyler festet til AFM spissen og deres samspill med ønsket underlaget er målt. Denne fremgangsmåten kan utvides til å studere proteinfolding ved å trekke protein fra overflaten. I tillegg, kan den brukes til å måle interaksjoner mellom celler og proteiner og bindingen av antistoffer til deres ligander. ^{37, 38, 39, 40} Dette notatet beskriver i detalj hvordan du fester enten peptider eller aminosyrer til AFM spissen hjelp silanol kjemi. I tillegg forklarer papir hvordan du utfører styrkemålinger og hvordan å analysereresultater.

Protocol

1. Tips Modification Kjøps silisiumnitrid (Si 3 N 4) AFM bommene med silisium tips (nominell cantilever radius på ~ 2 nm). Rengjør hver AFM cantilever ved å dyppe i vannfri etanol i 20 min. Tørk ved romtemperatur. Deretter behandle bommene ved å utsette dem for O to plasma i 5 min. Suspendere de rene tips ovennevnte (3 cm) en oppløsning inneholdende metyltrietoksysilan og 3- (aminopropyl) triethoxysilane i et forhold på 15: 1 (v / v) i en desikkator…

Representative Results

Figur 1 viser tuppen modifikasjon prosedyre. I det første trinnet, vil en plasmabehandling på overflaten av silisiumnitrid tips. Spissen presenterer OH-grupper. Disse gruppene vil da reagere med silaner. Ved slutten av dette trinn, vil overflaten på spissen dekket av frie NH2-grupper. Disse frie aminer vil da reagere med Fmoc -PEG-NHS, en kovalent linker. Fmoc-gruppen av PEG-linkeren fjernes ved pipyridine, et avbeskyttende reagens. Til slutt blir undersøk…

Discussion

Trinn 1.3, 1.4 og 1.7 i protokollen bør utføres med omfattende omsorg og i en meget skånsom måte. I trinn 1.3, bør spissen ikke være i kontakt med silan blandingen og den silanisering prosess bør utføres i en inert atmosfære (fuktighetsfri). ⁴⁵ Dette er gjort for å forhindre flerlags formasjon og fordi silan-molekyler lett undergå hydrolyse i nærvær av fuktighet. ⁴⁵

I trinn 1.4, bør temperaturen og tiden holdes på riktig måte. F…

Materials

Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips	Bruker (Camarilo, CA, USA)		MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm
Methyltriethoxysilane	Acros Organics (New Jersey, USA)		For Silaylation of the AFM tip
3-(Aminopropyl) triethoxysilane	Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)		Used for tip modification
Triisopropylsilane	Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)		Used for tip modification
N-Ethyldiisopropylamine	Alfa-Aesar (Lancashire, UK)		Used for tip modification
Triethylamine	Alfa-Aesar (Lancashire, UK)		Used for tip modification
Piperidine	Alfa-Aesar (Lancashire, UK)		Used for tip modification
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide  (Fmoc-PEG-NHS)	Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)		Used as the covalent flexible linker  (MW = 5000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)	Alfa Aser (Heysham, England)		Used as a coupling reagent.
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)	Acros Organics (New Jersey, USA)		Used as Solvent in Tip modification procedure
DMF (dimethylformamide)	Merck (Darmstadt, Germany)		Used as Solvent in Tip modification procedure
Trifluoro acetic acid (TFA)	Merck (Darmstadt, Germany)
Acetic anhydride	Merck (Darmstadt, Germany)
Peptides	GL Biochem (Shanghai, China).
Phenylalanine and Tyrosine	Biochem (Darmstadt, Germany)
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)	Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)		(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)
Mica substrates	TED PELLA, INC. (Redding, California, USA)		9.9 mm diameter