Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em> İn Vitro</em> Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından
Summary
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
DNA replikasyon bütün hücresel yaşam korunmuş bir özelliğidir. Çoğaltma bileşenlerinin kimlik ve sayısı çok çeşitlilik gösterirken, genel mekanizmalar evrim 1 arasında paylaşılır. Burada, T7 replizom bileşenleri ile in vitro koşullarında geri kalmış iplikli DNA sentezinin kinetik anlamaya yönelik radyoaktif substratlar kullanılarak jel bazlı, sürekli olmayan kinetik deneyler tarif eder. Bakteriyofaj T7 çoğaltma makineleri sadece dört protein (DNA polimeraz, GP5, ve processivity faktörü, E coli tiyoredoksin, iki fonksiyonlu primaz-sarmal GP4, ve tek sarmallı DNA bağlama proteini, GP2 oluşan çok basittir. 5) 2. Bu özellik, DNA replikasyonu katılan korunmuş biyokimyasal mekanizmaları incelemek için çekici bir model sistem yapar.
Özel önem, T7 DNA ile ribonükleotid primerlerin oluşumunun yerleştirilir bir Critica primazDNA sentezinin başlamasından l adımı. Buna ek olarak, bir de, reaksiyon karışımına ekleyerek, T7 DNA polimerazı veya başka kopyalama proteinlerine bu primerlerin kullanımı incelenebilir. T7 primaz-helikaz, GP4 primaz tanıma siteleri ya da PRS olarak adlandırılan özel DNA dizileri DNA sentezi için primerlerin oluşmasını (5'-GTC-3 ') katalize eder. PRS sitozin sitenin tanınması için gerekli olan, şifreli, ancak ürünün 3 kopyalanır değildir. GP4 ile astar sentezlenmesinde birinci basamak, daha sonra bir trimer genişletilmiş ve fonksiyonel olarak tetranukleotıd primerlere pppACCC, pppACCA veya pppACAC şablon 4 sekansına bağlı olan dinükleotidin pppAC, oluşturulmasını içerir. Bu primerler daha sonra da GP4 destekli proses 5, 6, DNA sentezini başlatmak için T7 DNA polimerazı ile kullanılabilmektedir. Bu bağlamda, primazetki, çıkmalarını engelleyen, şablonla son derece kısa tetraribonucleotides stabilize polimeraz aktif bölge 7 içine astar / şablon güvence için elverişli bir şekilde DNA polimeraz yürütmektedir. Bu adımlar (RNA primer sentezi, polimeraz primer yayınım ve uzatma) gecikmeli iplikçik çoğaltmak için birden fazla döngüleri tekrarlanır ve lider sarmalı replikasyonu ile koordine edilmelidir.
Burada tarif edilen deneyler, son derece hassas olan ve bir orta seviyede bir süre içinde gerçekleştirilebilir. Ancak, nispeten düşük verimlilik ve büyük bir dikkatle radyoaktif maddelerin kullanımı ve bertaraf olunmalıdır. Reaksiyon, bir sabit veya önceden kararlı durumda ya reaksiyon zamanı derslerin anlamlı analiz için mükellef zaman ölçeklerinde örnekleri ulaşmak için hızlı-söndürme cihazı istihdam olabilir hangi hızına bağlı olarak. Son zamanlarda, biz deneyleri Evidenc sağlamak için burada açıklanan kullanılanOkazaki parçaları başlamasında GP4 ve primaz alanından astar salınımının önemi, e. Ayrıca, verimli astar oluşumu ve kullanımı 8. teşvik, protein, gp2.5 bağlayıcı T7 tek iplikli DNA için bir düzenleyici rolünün kanıt bulunamadı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu deneyler en önemli faktör son derece aktif saflaştırılmış enzim mevcudiyetidir. GP4 ile çalışma sırasında, örneğin, -20 ° C'de% 50 gliserol ihtiva eden tampon maddesi içinde saflaştırılmış enzim depolama (20 mM potasyum fosfat, pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) içinde bulunan bir azalmaya yol açar birkaç ay boyunca preparatın spesifik aktivitesi. Bu nedenle, şu anda, saflaştırılmış 25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM NaCI, 0.1 mM EDTA, 1 mM TCEP içinde GP4 ve% 10 gliserol flaş dondurma, k?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
Referências
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA replication. , (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
