Стимуляция воспалительной реакции в первичной культурах гепатоцитов мышей
Summary
Здесь мы покажем подход ферментативной для выделения первичных гепатоцитов от взрослых мышей, и мы опишем количественную оценку воспалительного ответа с использованием ELISA и ПЦР в реальном времени.
Abstract
Печень играет решающую роль в регуляции системного воспаления. При хроническом заболевании почек, в частности, печень реагирует в ответ на уремический среды, окислительный стресс, эндотоксемии и уменьшением клиренса циркулирующих провоспалительных цитокинов, производя большое количество острой фазы реагентов. Экспериментальные инструменты для изучения воспаления и основная роль гепатоциты имеют решающее значение для понимания регулирования и вклад печеночных цитокинов в системной ответной реакции острой фазы и пролонгированное провоспалительных сценарий, особенно в сложной обстановке, таких как хроническое заболевание почек. Поскольку исследования сложных механизмов воспаления в естественных условиях остается сложной, ресурсоемкой и обычно требует использования трансгенных животных, первичные изолированные гепатоциты обеспечивают надежный инструмент , чтобы получить механистические идеи в печеночную реакции острой фазы. Так как этот метод в пробирке особенности умеренные затраты, высокая повторнои общие продуктивность технических знаний, первичные изолированных гепатоцитах также могут быть легко использованы в качестве скринингового подхода. Здесь мы опишем метод ферментативного основе для выделения первичных гепатоцитов мышиными, и мы описываем оценку воспалительного ответа в этих клетках с помощью ELISA и количественный ПЦР в реальном времени.
Introduction
Хроническая болезнь почек (ХБП) может быть определена как состояние острого и хронического воспаления 1. У больных с ХПН, уровни сывороточной phosphaturic фактора роста фибробластов 23 гормона (FGF23) постепенно повышаться с целью поддержания гомеостаза сывороточного фосфата 2. Повышенные уровни сыворотки FGF23 независимо друг от друга связаны с сердечно – сосудистой заболеваемости и смертности среди пациентов , которые начинают лечение гемодиализом 3, 4. Кроме того, некоторые клинические исследования показали сильную корреляцию между повышенными уровнями FGF23 и сывороточные уровни С-реактивного белка (CRP), интерлейкин-6 (IL-6) и фактор некроза опухоли альфа (ФНО) 5, 6. Кроме того, в экспериментальном исследовании, недавно мы показали, что FGF23 может нацелены непосредственно на гепатоциты и вызывают воспалительную реакцию путем увеличения CRP и IL-6 рroduction в печени 7. Следовательно, FGF23 может выступать в качестве циркулирующего фактора, который вносит свой вклад в системное воспаление в CKD.
В начале 70 -х годов, первичные гепатоциты были выделены и изучены впервые 8. С тех пор первичные культивируемые клетки печени широко используются для изучения обмена веществ обработки, гормональной функции, метаболизм лекарств, токсичность, а также иммунитета и воспалительных реакций 9, 10. Предыдущие протоколы основном описывали ферментативную выделение первичных гепатоцитов из ткани печени человека 11, 12. В то время как отличной модели, это оставляет вне возможность изучить, как генетические манипуляции затрагивает сложные механизмы печеночная сигнализации, а также функциональные последствия при различных типах стимулов. Далее мы опишем выделение мышиных первичных гепатоцитов, Следует отметить, что эффект нескольких медиаторов печеночной реакции острой фазы, такие как липополисахарида (LPS), IL-6 и FGF23 могут быть проанализированы в легкой, быстрой и воспроизводимым способом 13.
В данном случае мы приводим протокол для ферментативной изоляции гепатоцитов от взрослых мышей, и показано, что установленные индукторов воспалений, такие как LPS и IL-6, а также к новым медиаторов воспаления, таких как FGF23, может непосредственно стимулировать экспрессию и секрецию воспалительные цитокины, такие как CRP и IL-6 в культуре гепатоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разделительный первичных гепатоцитов у мышей является быстрым, недорогим и надежным инструментом для изучения воспалительных реакций бывших естественных условиях. Если выполнены правильно, результаты могут быть легко сгенерирована и воспроизведена в своевременной и экономиче…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH (R01HL128714 к CF) и (F31DK10236101 к КС) и Американской ассоциации сердца (CF и AG).
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
Referências
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
