Induktion av ett inflammatoriskt svar i Primär hepatocytkulturer från möss
Summary
Här visar vi en enzymatisk metod för att isolera primära hepatocyter från vuxna möss, och vi beskriver kvantifiering av ett inflammatoriskt svar med användning av ELISA och realtids-PCR.
Abstract
Levern spelar en avgörande roll i regleringen av systemisk inflammation. Vid kronisk njursjukdom i synnerhet reagerar levern som svar på uremiskt miljö, oxidativ stress, endotoxemi och minskad clearance av cirkulerande proinflammatoriska cytokiner genom att producera ett stort antal akut-fasreaktanter. Experimentella verktyg för att studera inflammation och den underliggande roll hepatocyter är viktigt att förstå reglering och bidrag lever cytokiner till en system akutfassvar och en långvarig pro-inflammatoriska scenario, särskilt i ett intrikat miljö såsom kronisk njursjukdom. Sedan studera komplexa mekanismer för inflammation in vivo förblir utmanande, resurskrävande och kräver vanligen användning av transgena djur, primära isolerade hepatocyter ger ett kraftfullt verktyg för att få mekanistiska insikter lever akutfasreaktion. Eftersom detta in vitro-teknik har måttliga kostnader, hög reproducerbarhet och gemensam teknisk kunskap, primära isolerade hepatocyter kan också lätt användas som en screening. Här beskriver vi en enzymatisk baserad metod för att isolera primära murina hepatocyter, och vi beskriver bedömningen av ett inflammatoriskt svar i dessa celler med hjälp av ELISA och kvantitativ realtids-PCR.
Introduction
Kronisk njursjukdom (CKD) kan definieras som ett tillstånd av akut och kronisk inflammation en. Hos patienter med kronisk njursjukdom, serumnivåer av phosphaturic hormonet fibroblasttillväxtfaktor 23 (FGF23) successivt öka för att bibehålla serumfosfat homeostas 2. Ökade serum FGF23 nivåer är oberoende i samband med kardiovaskulär morbiditet och mortalitet bland patienter som börjar hemodialysbehandling tre, fyra. Dessutom har flera kliniska studier visat en stark korrelation mellan förhöjda FGF23 nivåer och serumnivåer av C-reaktivt protein (CRP), interleukin-6 (IL-6) och tumömekrosfaktor α (TNF) 5, 6. Dessutom i en experimentell studie, har vi nyligen visat att FGF23 direkt kan rikta hepatocyter och orsakar ett inflammatoriskt svar genom att öka CRP och IL-6 produktion i levern 7. Därför kan FGF23 fungera som en cirkulerande faktor som bidrar till systemisk inflammation i CKD.
I början av 70-talet, primära hepatocyter isolerades och studerades för första gången 8. Sedan dess primära odlade leverceller har i stor utsträckning använts för att undersöka metabolisk behandling, hormonella funktion, läkemedelsmetabolism och toxicitet samt immunitet och inflammatoriska svar 9, 10. Tidigare protokoll har främst beskrivit enzymatiska isolering av primära hepatocyter från human levervävnad 11, 12. Medan en utmärkt modell, lämnar ut det här möjligheten att studera hur genetisk manipulation påverkar komplexa leversignaleringsmekanismer samt funktionella konsekvenser vid olika typer av stimuli. I det följande beskriver vi isoleringen av murina primära hepatocyter. Notably, kan effekten av flera mediatorer av den hepatiska akutfasreaktion, såsom lipopolysackarid (LPS), IL-6 och FGF23 analyseras på ett enkelt, snabbt och reproducerbart sätt 13.
Häri presenterar vi ett protokoll för enzymatisk isolering av hepatocyter från vuxna möss, och vi visar att etablerade inducerare av inflammation, såsom LPS och IL-6, samt nya inflammatoriska mediatorer, såsom FGF23, direkt kan stimulera uttryck och utsöndring av inflammatoriska cytokiner, såsom CRP och IL-6 i odlade hepatocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolera primära hepatocyter från möss är ett snabbt, billigt och tillförlitligt verktyg för att studera inflammatoriska responser ex vivo. Om det utförs på rätt sätt, kan resultaten lätt genereras och återges på ett lämpligt och kostnadseffektivt sätt. bör bedömas följande punkter noggrant för att säkerställa en lyckad isolering.
Det kirurgiska ingreppet och kanylering av IVC bör utföras under narkos och inte efter dödshjälp. En ung, oerfaren utredare kommer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH (R01HL128714 till CF) och (F31DK10236101 till KS) och American Heart Association (CF och AG).
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
Referências
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
