للدائرة نموذج ميكروفلويديك تدفق لصفائح الدم نقل والإرقاء يقيس ترسب الصفائح الدموية والليفين تشكيل في الوقت الحقيقي
Summary
وتصف هذه الورقة نموذج تجريبي من الارقاء الذي يقيس وقت واحد وظيفة الصفائح الدموية وتخثر الدم. يتم قياس الصفائح الدموية ومضان الليفين في الوقت الحقيقي، ويتم تحديد معدل الصفائح الدموية التصاق، ومعدل تجلط الدم، وبداية من تجلط الدم. يتم استخدام نموذج لتحديد خصائص الصفائح الدموية محفز التخثر تحت التدفق في المركزات لنقل الدم.
Abstract
نماذج ميكروفلويديك من الارقاء تقييم وظائف الصفائح الدموية في ظل ظروف القص الهيدروديناميكية، ولكن في وجود مضادات التخثر، وقيدت هذا التحليل لترسب الصفائح الدموية فقط. العلاقة المعقدة بين الكالسيوم 2+ معتمد على تجلط الدم والصفائح الدموية وظيفة تتطلب إعادة التكلس دقيق ورقابة من الدم قبل التحليل. يستخدم الإعداد لدينا قناة خلط على شكل حرف Y، التي تمد المركز الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ عازلة لتدفق الدم فقط قبل التروية، مما يتيح إعادة التكلس السريع دون عينة ركود. وهناك فرق عشرة أضعاف في سرعة تدفق بين مكامن يقلل من التخفيف. ثم يتم perfused الدم معادة التكلس في غرفة التحليل المغلفة الكولاجين، ويسمح وضع العلامات فرق التصوير في الوقت الحقيقي من كل من الصفائح الدموية والفيبرين ترسب باستخدام مضان الفيديو المجهر. ويستخدم هذا النظام فقط الأدوات المتاحة تجاريا، مما يزيد من فرص توحيد. إعادة تشكيل تروالدم mbocytopenic مع الصفائح الدموية من المختزنة يركز علاوة على ذلك نماذج الصفيحات نقل، مما يثبت استخدامه في هذا المجال البحثي. وأظهرت البيانات النموذجية أن بداية تجلط الدم وترسب الفيبرين كانوا يعتمدون خطيا على تركيز الصفائح الدموية، مما يؤكد العلاقة بين الارقاء الابتدائي والثانوي في نموذجنا. في إطار زمني من 16 دقيقة التروية، لم تفعيل الاتصال لم يحدث، على الرغم من إعادة التكلس إلى الكالسيوم العادي 2+ والمغنيسيوم 2+ المستويات. عندما تم تثبيط عامل التخثر XIIa التي كتبها المانع التربسين والذرة، وكان هذا الإطار الزمني لفترة أطول، مما يشير إلى مجموعة ديناميكية كبيرة فيها تغييرات في طبيعة محفز التخثر من الصفائح الدموية ويمكن تقييم. شارك في تجميد العامل النسيجي مع الكولاجين خفضت كثيرا من الوقت لبدء التخثر، ولكن ليس معدل. الخيار لدراسة العامل النسيجي و / أو مسار اتصال يزيد براعة وفائدة الفحص.
Introduction
وتصور الارقاء الابتدائي والثانوي في الأصل عن اثنين من العمليات الكيميائية الحيوية للانفصال نسبيا. كان ينظر الإرقاء الأولي كمساهم رئيسي في ظروف التدفق الشرياني، مع دورا رئيسيا لالصفائح الدموية، في حين كان ينظر الإرقاء الثانوي للسيطرة على تجلط الدم تحت تدفق الدم الوريدي، والسماح للسلسلة البروتيني لتشكيل الليفين غير قابلة للذوبان. أعادت تشكيل العقود القليلة الماضية هذه النظرة التقليدية إلى حد كبير، معترفا بأن نشاط الصفائح الدموية وتخثر مترابطة وهي عمليات لا تقل أهمية خلال الارقاء الفسيولوجية والمرضية في كل (غير المتطرفة) الأوساط الهيدروديناميكية. وقد ترجم هذا الرأي إلى العيادة، حيث يتزايد استخدامها المقايسات وضعت لقياس شامل تجلط كامل الدم، ولكن مع العديد من الأسئلة المتبقية على أهمية وإمكانية التطبيق وفائدة 1.
نشرنا مؤخرا تحليل وظيفي من الصفائح الدمويةيركز باستخدام غرف تدفق الموائع الدقيقة المغلفة مع الكولاجين ييفي في نموذج في المختبر من نقل 2، مع عينات تحتوي على كميات طبيعية من خلايا الدم الحمراء والبلازما والصفائح الدموية. يستخدم هذا الأسلوب الهيبارين أو هيرودين anticoagulated الدم، مما يعني ضمنا أي أو مشاركة محدودة من الارقاء الثانوي، والتي تعتمد على توليد الثرومبين والكالسيوم المتأين (كاليفورنيا 2+). لدعم تشكيل الثرومبين، وبالتالي لتشمل جميع جوانب الارقاء تحت تدفق ميكروفلويديك، قمنا بتطوير طريقة مكملة على القاعدة التقنية نفسها، بما في ذلك الآن مجانا الكالسيوم 2+. وبهذه الطريقة، ترسب الصفائح الدموية وتكوين الفيبرين يمكن دراستها، ومرة أخرى في نموذج نقل الصفائح الدموية، لتقييم الصفائح الدموية نوعية التركيز.
في هذه الطريقة، وصفت الصفائح والفيبرينوجين مع fluorophores التي فصلت تماما أطياف الانبعاث. اللون المزدوج، في الوقت الحقيقي الفيديو المجهر ثم يسمح تحليلالتصاق الصفيحات الأساسي، فضلا عن بدء تجلط الدم وترسب الفيبرين. متغير مهم في هذا النوع من الاختبار هو إعادة التكلس، لأن إضافة الكالسيوم 2+ إلى الدم ثابتة، قبل التروية، سيتسبب حتما تخثر بمبادرة الاتصال في الحاوية. سيكون هذا بدء التحيز قراءات بسبب انسداد الأنابيب وبيوشيب مداخل قبل التروية. لذلك، في أسلوبنا، anticoagulated سترات الدم وضخت في كاليفورنيا 2+ عازلة المحتوية على حدة من خلال الساقين العليا من غرفة مدخل على شكل حرف Y. يتم خلط المكونات أثناء التروية قبل الدخول إلى غرفة تحليل المغلفة مع الكولاجين وحده أو بالاشتراك مع عامل النسيج البشري المؤتلف (rhTF). من خلال تكييف سرعات تدفق مضخات منفصلة وتركيز الكالسيوم 2+ في المنطقة العازلة، وتخفيف 10٪ من عينة الدم النهائية تأخذ مكان.
باستخدام هذا البروتوكول الموسعة، ونحن لشرح مساهمة خثراتعامل نشوئها الثاني عشر (العامل XII) وتركيز الصفائح الدموية للاتصال مسار تخثر الشروع في ظل التدفق. تظهر البيانات المتوفرة لدينا أيضا أنه من خلال طلاء rhTF جنبا إلى جنب مع الكولاجين، ومسار العامل النسيجي يمكن قياسها بصورة متزامنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونقل الصفيحات مركزات يوصف للمريض نقص الصفيحات لمنع أو وقف النزيف. وقد أبرزت تأثيره السريرية مؤخرا في استعراض تاريخي للسرطان الدم الحاد 12، مشيرة إلى أن زيادة معدلات البقاء على قيد الحياة من الأطفال المرضى في الستينات والسبعينات تعزى إلى حد كبير إلى التحسينات في (الصفائح الدموية) الطب نقل الدم. يتم استخدام مركزات الصفيحات أيضا لوقف النزيف في مجال الصدمات النفسية الحادة أو أثناء الجراحة. في هذه الظروف، ويفضل الصفائح الدموية مع خصائص محفز التخثر ممتازة التي تبدأ بسرعة الارقاء، ولكن تعد مركزات الصفائح الدموية من التبرعات من المتبرعين، وعلى عكس الأدوية الدوائي، وموحدة من قبل التحضير فقط، وليس من قبل (الكيميائية) التكوين. لذلك، العديد من الأسئلة في مجال بنوك الدم هي التي لم يرد عليها، بما فيها تلك المتعلقة الطرائق المثلى للتبرع، وظروف التخزين، وممارسات نقل الدم. في مجال ررatelet (نقل) البيولوجيا، العديد من الأسئلة بشأن إزالة الخلايا من التداول، كما تبقى مساهمة الصفائح الدموية المنقول إلى الارقاء، أو المناعة التي لم يتم الرد عليها.
هي التقنيات المخبرية العديدة للتحليل وظيفة الصفيحات المتاحة، ولكن هذه تعالج في الغالب الجانب المفرد وظيفة الصفائح الدموية، مثل تجميع أو تحبب 13. لتقييم نطاق واسع الصفائح الدموية والمركزات الصفائح الدموية، ونماذج شاملة من الارقاء لا غنى عنها، وهذه يجب أن تشمل الهيدروناميكا. الريولوجيا الدم ضروري لتفسير السلوك الصفائح الدموية بشكل صحيح أثناء الارقاء 14 أو 15 أو تخثر 16، حتى لو منع تخثر الدم يمنع الكالسيوم 2+ و / أو الثرومبين للمشاركة في وجود سترات أو الهيبارين، على التوالي 2. لدراسة التفاعل بين تجلط الدم والصفائح الدموية وظيفة تحت تدفق 17، مطلوب 18 وتوليد الثرومبين العادي، وبالتالي، مجانا الكالسيوم 2+ كذلك. الإعداد التجريبية لدراسة الارقاء في ظل هذه الظروف معقدة، لأن التدابير لمنع "الأداة" أو التنشيط غير المنضبط للتخثر ينبغي أن تؤخذ قدر الإمكان. وعلاوة على ذلك، تستخدم العديد من المجموعات البحثية المتخصصة حسب الطلب الأجهزة 19 و 20، والذي يسبب التغير الكبير بين المختبرات 5. القيود النمطية لهذا النهج هي استخدام السفن مستطيلة، لمحات من تدفق غير نابض، ومواد الطلاء غير البشرية 5. مقايسة وصفنا هنا يستخدم الأدوات المتاحة تجاريا، وبالتالي قد تكون مناسبة لتوحيد.
لأنه يتم تنشيط رد فعل تجلط الدم شلال بسهولة مرة واحدة لا يرد الدم داخل الجسم البشري، إعادة التكلس تسيطر هي خطوة محورية. تيس تحقيق ذلك، إضافة الكالسيوم 2+ يجب تأجيلها إلى قبل نضح على سطح الكولاجين رد الفعل، لأنه عندما يتم تزويد 2+ عازلة الكالسيوم بكميات كبيرة إلى الدم ثابتة، تخثر يأخذ حتما مكان، في نهاية المطاف انسداد الأنابيب ويتحامل البيانات تفسير (لا تظهر البيانات). الحل لهذه المشكلة هو ضخ العازلة الكالسيوم 2+ والدم على حدة، مما يسمح لخلط من قبل قوات الحمل الحراري وناشر خلال نضح في طريقها إلى غرفة التحليل. ويتحقق الاختلاط الكامل في قطعة 46 سم من الأنابيب بين الاختلاط وتحليل الدوائر. تم احتساب هذه المدة لمدة بقاء الأمثل من الكواشف إلى المزيج على أساس القوانين الأساسية للكتلة والنقل الحمل الحراري 21 خلال نضح بمعدل تدفق المستخدمة (1000 ق -1). أثبت هذا النهج يمكن السيطرة عليها وقابلة للتكرار.
تفعيل الاتصال من تجلط الدم وينظر أحيانا باعتبارها الأداة بسيطةاخذ عينات من الدم ويجب تجنبها عند تفسير زمن التجلط. لذلك، أثبتنا أنه في حالة عدم وجود موانع، يبدأ تجلط الدم تلامس يسببها في 16.7 دقيقة (± 3.7 دقيقة) التروية. في ظل وجود CTI لمنع تفعيل الاتصال FXIIa بوساطة، لا يبدأ تجلط الدم خلال تعريفها بشكل تعسفي من التجربة (30 دقيقة). هذه النافذة من التجريب هو طويل بما فيه الكفاية لتمييز عينات التي هي المؤيدة أو جرعات. على الرغم من تجلط الدم عن طريق تفعيل الاتصال يمكن أن يكون نتيجة غير مرغوب فيها من الدم بالاتصال الأسطح الاصطناعية، بياناتنا تظهر تأثير جرعة البيولوجي واضح من الصفائح الدموية. هذا يمكن أن يكون هاما للطب نقل الدم، بسبب النتائج الأخيرة على العامل XII، الصفائح الدموية فوسفات 10، توزيع فسفاتيديل 22، والمجهرية الدقيقة الصفائح الدموية 23 وإعادة تقييم الواقع بالتماس التخثر كما مساهما هاما في الارقاء، والبريدوخاصة في سياق تخثر 24. على سبيل المثال، فإن العائد المتغير من نقل الصفائح الدموية لدى مرضى أو التعبير فسفاتيديل متغير من الصفائح الدموية راهن قد بالتالي تحفز التغير في الكفاءة العلاجية إذا ثبت تخثر الناجح يعتمد على هذه العوامل.
بواسطة lipidated rhTF شارك في شل حركة مع الكولاجين، الطريق تخثر خارجي، أو TF مسار، يتم تنشيط خلال ترسب الصفائح الدموية على الكولاجين. ويمتد هذا الفحص إلى الوضع الأكثر شمولا، كنموذج للإصابات التي تجلب الدم في اتصال مع الخلايا التي تحمل TF والأنسجة. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن شارك في تجميد الكولاجين وTF ينخفض لحظة بداية تجلط الدم ولكن لا يغير من معدل تجلط الدم. من المذكرة، وكمية من rhTF ثبتوا على السطح هو متغير مهم في هذا النموذج 25 و 26 و يجب أن تكون موحدة ضمن دراسة معينة. في presenم من CTI، مسار TF يمكن دراستها على وجه الحصر (لا يظهر) لأنه يتم منع تفعيل الاتصال.
في الختام، لدينا الإعداد التجريبية يجمع نموذجا للنقل عن طريق إعادة الدم الصفيحات مع الصفائح الدموية راهن ونموذج من الارقاء التي تعتمد على الكالسيوم ترسب الصفائح الدموية وتكوين الفيبرين تحت تدفق الهيدروديناميكية. وسيتم استخدام هذا الاختبار للرد على أسئلة حول طبيعة محفز التخثر الصفائح الدموية راهن وتقنيات إعداد التركيز آثار الصفائح الدموية لديها في هذا الشأن.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة البحوث والتنمية من الصليب الأحمر، فلاندرز خدمة الدم البلجيكية. ونحن نعترف بالدعم المالي المقدم من "Bijzonder onderzoeksfond" (محايد – صندوق الأبحاث الخاص) من جامعة غنت الممنوحة للمشروع مع عدد العقد BOF30290744.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | A00434 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 2 mL Syringe | BD | 307727 | |
| Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
| Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
| Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
| Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
| VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
| Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| ZEN2012 software | Zeiss |
Referências
- Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823 (2016).
- Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).
- Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta. 1376 (3), 433-453 (1998).
- Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).
- Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79 (2), 380-388 (1992).
- Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).
- Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).
- Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).
- Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y. Platelet Transfusions in Acute Leukemia. N. Engl. J. Med. 375 (1), 96-97 (2016).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).
- Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).
- Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).
- Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
- Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).
- Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).
- Podoplelova, N. A., et al. . Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. , (2016).
- Der Meijden, P. E. V. a. n., et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).
- Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).
- Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).
- Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).
