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Genetics

क्रोमेटिन को संशोधित करने के थोक क्रोमेटिन बाइंडिंग गुणों के विश्लेषण के लिए अनुक्रमिक नमक निकालने के परिसरों

Published: October 2, 2017 doi: 10.3791/55369
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University

Summary

क्रोमेटिन बंधे प्रोटीन के अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण बड़े प्रोटीन परिसरों की बाध्यकारी गुणों का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है । इस विधि को थोक क्रोमेटिन करने के लिए एक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के समग्र संबध में व्यक्तिगत उपइकाई या डोमेन की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

Abstract

क्रोमेटिन के बाध्यकारी गुणों के Elucidation-लक्ष्यीकरण प्रोटीन बहुत क्रोमेटिन के जटिल प्रकृति और सबसे स्तनधारी क्रोमेटिन के विषम प्रकृति-संशोधित परिसरों के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । आदेश में इन बाधाओं को दूर करने के लिए, हम क्रोमेटिन के सापेक्ष बाध्यकारी समानताएं के मूल्यांकन के लिए एक अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण (SSE) परख अनुकूलित किया है परिसरों । यह आसान और सरल परख गैर द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है विशेषज्ञों के दो संबंधित परिसरों के संबंध बंधन में सापेक्ष अंतर का मूल्यांकन करने के लिए, एक जटिल जब एक उपइकाई खो दिया है या एक व्यक्ति डोमेन निष्क्रिय है के संबंध में परिवर्तन, और में परिवर्तन क्रोमेटिन परिदृश्य को बदलने के बाद समानता बाध्यकारी । क्रमिक रूप से, नमक की मात्रा बढ़ाने में बल्क क्रोमेटिन को सस्पैंड करके, हम क्रोमेटिन से एक विशेष प्रोटीन का रेफरेंस प्रोफाइल कर सकते हैं । इन प्रोफाइल का प्रयोग, हम कैसे एक क्रोमेटिन में परिवर्तन का निर्धारण करने में सक्षम है-जटिल या परिवर्तन क्रोमेटिन पर्यावरण को संशोधित बाध्यकारी बातचीत को प्रभावित । युग्मन SSE के साथ अन्य इन विट्रो में और vivo परख में , हम क्रोमेटिन वातावरण की एक किस्म में एक जटिल की कार्यक्षमता पर व्यक्तिगत डोमेन और प्रोटीन की भूमिकाओं का निर्धारण कर सकते हैं.

Introduction

युकेरियोटिक कोशिकाओं में डीएनए विनियमन एक जटिल और परिष्कृत प्रणाली है कि कसकर प्रोटीन का एक वर्गीकरण है कि intracellular और extracellular उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं का समंवय द्वारा नियंत्रित है । डीएनए citrullinated octamers के आसपास लिपटे के लिए nucleosomes फार्म का है, जो ढीला डीएनए के साथ वितरित किया जा सकता है या तंग कुंडल1में संकुचित है । डीएनए और histones के इस संरचनात्मक व्यवस्था क्रोमेटिन, जो प्रोटीन के एक नेटवर्क द्वारा विनियमित है के रूप में जाना जाता है कि पढ़ें, लिखें, और histones पर पोस्ट शोधों संशोधनों (PTM) मिटा2। कुछ citrullinated PTMs, जैसे acetylation, एमिनो एसिड वे पर जमा कर रहे है के प्रभारी बदलने के लिए, histones और डीएनए के बीच बातचीत में फेरबदल2। citrullinated PTMs भी transcriptional नियामकों की भर्ती करने के लिए सेवा, क्रोमेटिन रिमॉडलर, डीएनए क्षति की मरंमत मशीनरी, और डीएनए की प्रतिकृति मशीनरी जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए3।

क्रोमेटिन बातचीत या तो जांच छोटे पैमाने पर बातचीत या बड़े जीनोम व्यापक विश्लेषण शामिल अध्ययन के लिए ज्यादातर तरीके । इन विट्रो में बाध्यकारी अध्ययन अक्सर citrullinated पेप्टाइड्स या ट्रो गतिशीलता बदलाव परख (EMSA), इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry, प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण, और पेप्टाइड pulldowns के रूप में परख में डीएनए के साथ व्यक्तिगत संयोजक डोमेन का उपयोग । क्योंकि इन परख आम तौर पर एक व्यक्ति के प्रोटीन डोमेन पर ध्यान केंद्रित, वे पहेली का एक छोटा सा टुकड़ा की समझ की सुविधा है, लेकिन हमें बहु के सहकारी प्रकृति-डोमेन प्रोटीन को समझने की अनुमति नहीं है, अकेले जाने बहु में अपनी भूमिका प्रोटीन परिसरों. intricacy की एक और परत सबसे स्तनधारी क्रोमेटिन के विषम संरचना द्वारा जोड़ा गया है-परिसरों को संशोधित । इस प्रोटीन विविधता, क्रोमेटिन परिदृश्य के गतिशील प्रकृति के साथ संयोजन में, यह दोहराऊंगा के लिए क्रोमेटिन प्रोटीन के vivo बाध्यकारी बातचीत में क्रोमेटिन करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है इन विट्रो।

vivo में तरीकों ने महत्वपूर्ण प्रगति की है; हालांकि, वे अक्सर महंगे हैं, समय लगता है, और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण । क्रोमेटिन immunoprecipitation sequencing द्वारा पीछा किया (चिप-seq) जीनोम भर में प्रोटीन और citrullinated संशोधनों के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए बहुत उपयोगी है, लेकिन यह पर्याप्त अनुकूलन4की आवश्यकता है. प्रोटीन अक्सर crosslinked को क्रोमेटिन करने के लिए बातचीत की रक्षा कर रहे हैं; हालांकि, इस कृत्रिम बातचीत का उत्पादन कर सकते है और epitope मास्किंग5कारण हो सकता है । इसके अलावा, immunoprecipitations (आईपी) अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, और चिप द्वारा डीएनए कतरनी और आईपी शर्तों के व्यापक अनुकूलन-qPCR एक ज्ञात बंधन साइट है, जो अक्सर उपलब्ध नहीं है का उपयोग कर एक प्राथमिकताओं। चिप शर्तों के अनुकूलन के बाद, नमूनों की प्रोसेसिंग महंगा है और अनुक्रम और विश्लेषण करने के लिए महीनों के लिए कई हफ्तों की आवश्यकता है । हालांकि इस विधि के जीनोम भर में क्रोमेटिन बाध्य प्रोटीन के स्थानीयकरण की पहचान के लिए अमूल्य है, लागत और समय प्रतिबद्धता यह इस विधि का उपयोग करने के लिए कैसे छोटे परिवर्तन वैश्विक बाध्यकारी गुणों को प्रभावित कर सकता है के बारे में परिकल्पनाओं उत्पंन करने के लिए प्रतिबंधित कर .

इस पत्र में, हम वर्णन कैसे एक अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण (SSE) परख के लिए क्रोमेटिन-बाध्य प्रोटीन की वैश्विक बाध्यकारी प्रोफाइल की जांच और भेद कैसे एक प्रोटीन, जटिल, या वैश्विक PTM प्रोफ़ाइल में परिवर्तन बातचीत बदल सकते है इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि नमक निकालने एक सामांयतः और मोटे तौर पर तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं, हम प्रदर्शन कैसे इस अनुक्रमिक विधि अत्यधिक प्रतिलिपि और बहुमुखी है । SSE हमें अनुमति देता है कि कैसे एक जटिल या यहां तक कि एक डोमेन के एक उपइकाई थोक क्रोमेटिन के लिए जटिल समग्र संबंध के लिए योगदान की विशेषता है । SSE भी अगर एक प्रोटीन की बाध्यकारी क्रोमेटिन परिदृश्य में परिवर्तन से प्रभावित है, यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है citrullinated निशान लक्ष्यीकरण कि चिप seq और अंय जीनोम व्यापक अध्ययन का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है के लिए दिलचस्प परिकल्पना प्रदान करते हैं ।

हम मूलतः वू एट अल से इस पद्धति को अनुकूलित, Polybromo1 (PBRM1) के समारोह की जांच करने के लिए PBAF क्रोमेटिन रिमॉडलर6,7के बंधन में । इस तकनीक का प्रयोग, हम PBAF क्रोमेटिन remodeling परिसर के भीतर बाध्यकारी क्रोमेटिन के लिए PBRM1 की भूमिका निर्धारित की है और फिर इस समारोह में छह व्यक्ति bromodomains के सापेक्ष योगदान निर्धारित7।

यहां हम वर्णन कैसे इस विधि का अनुकूलन करने के लिए विभिंन प्रकार के सेल में क्रोमेटिन बंधन का पता लगाने के लिए, इसी तरह के क्रोमेटिन के सापेक्ष बाध्यकारी संबंध का आकलन करने के लिए जटिल संशोधित, एक रासायनिक अवरोध करनेवाला द्वारा क्रोमेटिन से एक प्रोटीन के विस्थापन की जांच, और क्रोमेटिन लैंडस्केप करने के लिए परिवर्तन के बाद क्रोमेटिन बाध्यकारी के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. तैयारी

  1. hypotonic समाधान बफ़र A: ०.३ M सुक्रोज, ६० mm KCl, ६० mm Tris पीएच ८.०, 2 मिमी EDTA, और ०.५% NP-४० के १०० मिलीलीटर तैयार करें । दुकान पर 4 & #186; ग.
    नोट: कुछ कक्ष रेखाओं, जैसे HEK293T, कम सख़्त lysing स्थितियों की आवश्यकता होती है । यदि नाभिक लाइसे आसानी से, का उपयोग करें संशोधित बफ़र A: 25 mm HEPES pH ७.६, 25 mm KCl, 5 mm MgCl 2 , ०.०५ mm EDTA, ०.१% NP-४०, and 10% ग्लिसरॉल.
  2. 2x mRIPA समाधान के २५० मिलीलीटर स्टॉक समाधान तैयार: १०० mM Tris पीएच ८.०, 2% NP-४०, और ०.५% सोडियम deoxycholate.
  3. 5 एम NaCl के १०० मिलीलीटर स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें ।
  4. 2x mRIPA और 5 मीटर NaCl समाधान का उपयोग कर, छह नमक सांद्रता में से प्रत्येक के लिए 1x mRIPA समाधान के ५० मिलीलीटर तैयार: 0 मिमी, १०० मिमी, २०० मिमी, ३०० मिमी, ४०० मिमी, और ५०० मिमी NaCl । प्रयोग शुरू करने से पहले, बर्फ पर सभी समाधान शांत ।
  5. वांछित शर्तों के तहत सेल लाइनों हो जाना ।
    नोट: जब एक प्रोटीन नीचे दस्तक के प्रभाव का निर्धारण, पछाड़ना लाइन के लिए SSE wildtype कोशिकाओं की तुलना में होना चाहिए । इन SSE की ओर से किया जाना चाहिए । रासायनिक अवरोधकों या उत्तेजनाओं का उपयोग उदाहरण के लिए, 3-5.
    6. वर्गों को देखें
< p class = "jove_title" > 2. मूल अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण

  1. फसल प्रत्येक शर्त के ८,०००,००० कोशिकाओं और दो बार बर्फ ठंडा पंजाबियों के 5 मिलीलीटर के साथ धो लो ।
    नोट: यह समकक्ष प्रोटीन सांद्रता के लिए कक्षों की बराबर संख्या है करने के लिए महत्वपूर्ण है । कोशिकाओं की सही संख्या व्यक्तिगत सेल लाइनों या विशेष रूप से प्रोटीन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है । यह महत्वपूर्ण नहीं है बहुत अधिक है, के रूप में प्रोटीन सांद्रता में वृद्धि रेफरेंस वक्र है, जो संतुलन बंधन पर निर्भर है के प्रेक्षण को रोकने जाएगा । हालांकि, बहुत कुछ के साथ & #160; कक्ष वक्र का पता लगाने के लिए पर्याप्त प्रोटीन नहीं हो सकता है, और क्रोमेटिन गोली अलग करने के लिए कठिन है और अंशों के बीच खो सकता है ।
  2. पुन: एक बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित एक + चिढ़ाने अवरोधकों, १.५ मिलीलीटर माइक्रो केंद्रापसारक ट्यूबों में स्थानांतरण, और ऊपर नीचे घुमाएं पर 4 & #186; C के लिए 10 min.
  3. 5 मिनट के लिए ६००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा नाभिक अलग 4 & #186; C.
    नोट: इस चरण के बाद परमाणु लिफाफा अभी भी बरकरार रहना चाहिए. यदि परमाणु लिफाफा बरकरार है, गोली पूरी तरह से फिर से निलंबित कर देंगे; हालांकि, जब लिफाफा लीजड और क्रोमेटिन जारी किया गया है, गोली फिर से निलंबित नहीं होगा । यदि परमाणु लिफाफा बफर एक मशीन के बाद बरकरार नहीं है, का उपयोग करें संशोधित बफर a.
  4. Add २०० & #181; mRIPA 0 mM NaCl के एल + एक नाभिक गोली करने के लिए फिर से पहले गोली सस्पैंड अवरोधकों । Homogenize प्रत्येक नमूने को 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ 15 बार pipetting करके । गोली फिर से आसानी से स्थगित करना चाहिए, तथापि, नाभिक लाइसे जाएगा के रूप में यह pipetted है और नमूना मोटी और चिपचिपा और पिपेट के लिए मुश्किल हो जाएगा ।
    1. आदेश में टिप में गोली आकर्षित करने के लिए, केंद्रापसारक ट्यूब के नीचे के खिलाफ पिपेट टिप के अंत नल । गोली पूरी तरह से एक बार डीएनए नाभिक से जारी है भंग नहीं होगा, लेकिन pipetting यह टूट जाएगा ।
  5. जब सभी नमूनों homogenized किया गया है, 3 min.
    के लिए बर्फ पर सभी नमूनों की मशीन नोट: मशीन समय ब्याज की प्रोटीन के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  6. 4 & #186 पर ६५०० x g पर 3 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक द्वारा क्रोमेटिन गोली अलग; C.
  7. एक साफ १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण supernatant । यह 0 मिमी अंश होगा । यह 0 मिमी mRIPA समाधान नाभिक lysis के लिए एक धोने कदम के रूप में कार्य कर सकते हैं और किसी भी ढीला प्रोटीन क्रोमेटिन के साथ जुड़े नहीं हटा.
  8. Add २०० & #181; mRIPA १०० mM NaCl के एल + फिर से पहले गोली सस्पैंड प्रत्येक क्रोमेटिन गोली करने के लिए अवरोधकों को छेड़ो । ऊपर गोली pipetting और 15 बार नीचे से क्रोमेटिन गोली तोड़ ।
    नोट: यह समय की संख्या के साथ संगत होना महत्वपूर्ण है pipetted.
    9. में गोली
  9. 3 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन । इस मशीन कदम सभी नमूनों एक संतुलन राज्य है, जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब वहां कई नमूने है तक पहुंचने के लिए अनुमति देता है ।
  10. केंद्रापसारक पर 3 मिनट के लिए ६५०० x g पर 4 & #186; ग और एक साफ १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण supernatant.
  11. दोहराने २.६-२.१० शेष नमक सांद्रता के लिए ।
    नोट: ४०० मिमी NaCl के बाद, mRIPA गोली स्पष्ट और gloopy होना चाहिए और ट्यूब के तल पर नहीं रह जाएगा. गोली केंद्रापसारक ट्यूब के ढक्कन में रखा जा सकता है, जबकि supernatant पृथक ।
  12. Add ७० & #181; 4x प्रोटीन लोड हो रहा है डाई के प्रत्येक अंश और लोड 30 & #181; l के लिए एक एसडीएस acrylamide जेल पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए पर प्रत्येक अंश का l.
    नोट: प्रोटीन के बंधन प्रोफ़ाइल निर्धारित करने के लिए, यह lysate के बराबर मात्रा लोड करने के लिए महत्वपूर्ण है, बजाय बराबर प्रोटीन सांद्रता लोड हो रहा है ।
  13. एक झिल्ली पर स्थानांतरित और ब्याज के प्रोटीन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके एक मानक पश्चिमी दाग प्रदर्शन ।
  14. क्रोमेटिन से प्रोटीन eluted quantitate करने के लिए, अवरक्त प्रतिदीप्ति IRDye माध्यमिक एंटीबॉडी और एक imager के साथ छवि दाग में दाग गर्मी । जबकि विकास के अंय तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है, हम प्रतिदीप्ति या अवरक्त इमेजिंग की सिफारिश, के रूप में यह प्रकृति में और अधिक मात्रा में है ।
  15. प्रत्येक नमक एकाग्रता पर प्रोटीन eluted के लिए तीव्रता की गणना करने के लिए ImageJ या इसी तरह के सॉफ्टवेयर का उपयोग करें । नमक एकाग्रता के खिलाफ बैंड तीव्रता ग्राफ करके, ब्याज की अपने प्रोटीन का रेफरेंस पैटर्न निर्धारित किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 3. एक & #34 की उपस्थिति में अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण; रीडर & #34; अवरोध करनेवाला

  1. फसल कोशिकाओं के दो सेट (४,०००,०००) और एक मानक SSE में के रूप में नाभिक को अलग.
  2. पुन: निलंबित दोनों सेटों में २०० & #181; mRIPA के एल 0 मिमी NaCl और 3 मिनट के लिए मशीन । यह नाभिक में किसी भी मुक्त प्रोटीन के हटाने के लिए अनुमति देगा ।
  3. Add २०० & #181; L mRIPA 0 mM NaCl प्रत्येक गोली. नियंत्रण सेट करने के लिए एक नमूना और DMSO के लिए अवरोधक (2 & #181; L 1 mM (+) JQ1) जोड़ें ।
  4. 15 बार pipetting द्वारा गोली आंदोलन और 5 मिन.
    5. के लिए बर्फ पर मशीन
  5. केंद्रापसारक पर 3 मिनट के लिए ६५०० x g पर 4 & #186; ग और एक साफ १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण supernatant.
  6. दोहराने ३.३-4 सभी नमक सांद्रता के लिए और एक मानक पश्चिमी दाग प्रदर्शन करते हैं ।
< p class = "jove_title" > 4. एक & #34 की उपस्थिति में अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण; लेखक & #34; अवरोध करनेवाला

  1. के साथ कोशिकाओं का इलाज अवरोध करनेवाला (10 & #181; M साह) या DMSO 3 ज.
  2. हार्वेस्ट ४,०००,००० प्रत्येक उपचार के लिए कोशिकाओं.
  3. अवरोध करनेवाला के साथ नमूनों के लिए एक मानक SSE प्रदर्शन सभी बफ़र्स के लिए जोड़ा.
< p class = "jove_title" > 5. अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण निंनलिखित डीएनए क्षति

  1. 1 के साथ कोशिकाओं का इलाज & #181; M डॉक्सोरूबिसिन 1 ज.
  2. कोशिकाओं पर मीडिया बदलने के लिए और उंहें 3 एच
    3. के लिए ठीक करने की अनुमति
  3. फसल ८,०००,००० कोशिकाओं और प्रदर्शन बुनियादी SSE.
< p class = "jove_title" > 6. गैर अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण

  1. फसल १२,०००,००० कोशिकाओं और पंजाबियों के साथ धो लो.
  2. कोशिकाओं विभाजित इतना है कि वहां माइक्रो केंद्रापसारक ट्यूब प्रति २,०००,००० कोशिकाओं रहे हैं ।
  3. Re-सस्पेंड in ५०० & #181; एक बफर के एल और 10 मिनट
    4. के लिए मशीन
  4. ६००० x g.
    5. पर केंद्रापसारक द्वारा नाभिक अलग
  5. एक २०० में फिर से निलंबित छर्रों & #181; प्रत्येक mRIPA के L थें + NaCl.
  6. प्रत्येक नमूने को 1 मिलीलीटर पिपेट टिप के साथ 15 बार pipetting करके Homogenize ।
  7. 3 min.
    8. के लिए बर्फ पर मशीन
  8. ६५०० x जी पर केंद्रापसारक द्वारा क्रोमेटिन अलग और स्वच्छ ट्यूबों के लिए supernatant हस्तांतरण । Add ७० & #181; लोड हो रहा है डाई का l और रन 30 & #181; l पर एक एसडीएस पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए पृष्ठ जेल.

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Representative Results

इस पत्र में, हम लाभ और सामांय रूप से प्रयुक्त अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण (SSE) विधि है कि हम साहित्य6से अनुकूलित है के अनुप्रयोगों के प्रदर्शन । चित्रा 1में, हम ARID1a और PBRM1 के रेफरेंस पैटर्न का पता लगाने के द्वारा गैर-क्रमिक रूप से प्रोटीन निकालने के लिए SSE के reproducibility की तुलना करें । हम लगातार कि ARID1a, एक बाफ उपइकाई, elutes मुख्य रूप से २०० mm NaCl और PBRM1, एक अनंय PBAF उपइकाई, elutes में मुख्य रूप से ३०० mm NaCl पर निरीक्षण करते हैं । चित्र 1a ८,०००,००० OVCA429 कक्षों के साथ SSE के तीन स्वतंत्र प्रतिकृति दिखाता है । चित्र 1b एक गैर-अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण जहां नाभिक २,०००,००० कोशिकाओं से अलग एक नमक बफर में पुनः निलंबित कर दिया गया दर्शाया गया है । हालांकि दोनों तरीकों का निष्कर्ष है कि ARID1a elutes पर २०० mm और PBRM1 elutes में ३०० mm, SSE एक अच्छी तरह से परिभाषित बाध्यकारी प्रोफ़ाइल का उत्पादन और इन दो परिसरों के बंधन का स्पष्ट भेद के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, गैर-क्रमिक विधि में, ४०० mm और ५०० mm NaCl बफ़र्स में eluted प्रोटीन की मात्रा ३०० mm से कम है और तीन प्रतिकृति के बीच असंगत है । हालांकि इस मुद्दे को और अधिक अनुकूलन के साथ हल किया जा सकता है मशीन समय और केंद्रापसारक गति, यह SSE के reproducibility लाभ दिखाता है ।

हमारे अनुकूलन के माध्यम से, हमने पाया है कि अंय क्रोमेटिन परिसरों और अधिक समय की आवश्यकता के लिए eluted हो सकता है । चित्रा 2में, हम यह है कि transcriptional उत्प्रेरक, PBAF, क्रोमेटिन से लगातार 3 मिनट और 10 मिनट की मशीन के समय के साथ SSEs के बीच elutes प्रदर्शित करता है । इसके विपरीत, transcriptional दमन के रेफरेंस, Polycomb दमनात्मक परिसर 1 (PRC1), बीएमआई-1 द्वारा संकेत दिया, एक लंबे समय तक मशीन क्रोमेटिन से जारी किया जा करने के लिए8की आवश्यकता है । इस घटना के कारण हो सकता है PRC1 के जीनोम के अधिक कॉंपैक्ट और दुर्गम क्षेत्रों में स्थानीय जा रहा है, या दो परिसरों के लिए अंतर बाध्यकारी कैनेटीक्स के कारण हो सकता है ।

एक विशेष प्रोटीन के लिए अनुकूलन के बाद, SSEs कैसे विभिंन स्थितियों में प्रोटीन बाध्यकारी परिवर्तन की शक्ति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । SSE प्रोटीन के एक अवरोधक की प्रभावशीलता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रोटीन बातचीत । इस अवधारणा को प्रदर्शित करने के लिए, हम उपयोग (+) JQ1, जो एक BRD4 bromodomain अवरोध करनेवाला है, की जांच करने के लिए यह कैसे बदल BRD4 बाध्यकारी (चित्र 3ए)9। हम ४,०००,००० OVCA429 कोशिकाओं से नाभिक पृथक । किसी भी अनबाउंड BRD4 को निकालने के लिए, एक प्रारंभिक 0 मिमी वॉश दोनों नमूनों पर किया गया था । तब DMSO या 1 µ m (+) के साथ एक मानक SSE का प्रदर्शन किया गया JQ1 प्रत्येक अंश में जोड़ा गया । नमूने के लिए 5 मिनट की मशीन थे । हम मानते है कि BRD4 elutes अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में पहले DMSO की तुलना में । यह दिखाने के लिए कि (+) JQ1 BRD4 के लिए विशिष्ट है, हम ARID1a के लिए blotted और रेफरेंस (चित्र बी) में कोई परिवर्तन नहीं देखा.

अगले हम जांच कैसे प्रोटीन बाध्यकारी बदला जा सकता है जब क्रोमेटिन के परिदृश्य संशोधित किया है । BRD4 में दो bromodomains हैं जो citrullinated मासा10पर acetylated lysine अवशेषों को पहचानते हैं । citrullinated acetylation के स्तर को बढाने के लिए हमने OVCA429 कोशिकाओं का इलाज किया जिसमें से 10 µ मीटर के citrullinated deacetylase अवरोधक suberanilohydroxamic एसिड (साहा) 3 एच के लिए साहा (10 µ मी) को SSE के दौरान सभी बफ़र्स में जोड़ा गया । वैश्विक citrullinated acetylation स्तर में वृद्धि करके, हम BRD4 बंधन में वृद्धि (चित्रा 4a) मनाया । जब ARID1a के लिए सोख्ता, हम ARID1a के कडे बंधन के रूप में अच्छी तरह से निरीक्षण, जो आश्चर्य की बात नहीं है, क्योंकि इस तरह के BRG1, BRM, और BRD9 के रूप में बाफ परिसर के उपइकाई, सभी bromodomains10,11 (चित्रा 4b) होते हैं ।

अंत में, प्रदर्शित करने के लिए कैसे SSE कैसे प्रोटीन बाध्यकारी परिवर्तन देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब कोशिकाओं जीनोमिक परिवर्तन का अनुभव है, हम तोपोइसोमेरसे द्वितीय अवरोध करनेवाला के साथ डबल असहाय डीएनए टूट प्रेरित,12डॉक्सोरूबिसिन । हम एक घंटे के लिए डॉक्सोरूबिसिन के 1 µ m के साथ HEK293T कोशिकाओं का इलाज किया और तीन घंटे के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी कोशिकाओं. SSE प्रदर्शन करने के बाद, हम PBRM1 के लिए blotted, जो डीएनए में शामिल है नुकसान की मरंमत13। हम PBRM1 बाइंडिंग के लिए दो चोटियों मनाया: ३०० mm पर एक और ५०० mm NaCl पर एक (चित्रा 5) । यह पता चलता है कि PBRM1 जनसंख्या के कुछ आम तौर पर बाध्यकारी है, लेकिन PBRM1 का एक सबसेट और अधिक कसकर डीएनए क्षति के बाद क्रोमेटिन के लिए बाध्य है । यह कैसे SSE का उपयोग करने के लिए कैसे क्रोमेटिन बातचीत अलग बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में बदल रहे है की जांच करने का सिर्फ एक उदाहरण है ।

Figure 1
चित्रा 1: OVCA429 कोशिकाओं में अनुक्रमिक नमक निकालने की तुलना में गैर अनुक्रमिक
क) अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण विधि द्वारा ARID1a और PBRM1 रेफरेंस प्रोफाइल के तीन स्वतंत्र Immunoblots और ठहराव की प्रतिकृति । B) गैर-अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण विधि में ARID1a और PBRM1 रेफरेंस प्रोफाइल के तीन स्वतंत्र Immunoblots और ठहराव की प्रतिकृति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: PBAF और PRC1 रेफरेंस प्रोफाइल की गर्मी के समय की तुलना
क) PBAF की तुलना (PBRM1) 3 और 10 मिनट की मशीन समय के साथ रेफरेंस प्रोफाइल । ख) PRC1 की तुलना (बीएमआई-1) 3 और 10 मिनट की मशीन के समय के साथ रेफरेंस प्रोफाइल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: की प्रभावशीलता (+) JQ1 पर बाधा BRD4 बाध्यकारी
क) OVCA429 कोशिकाओं में DMSO नियंत्रण की तुलना में १ µ मीटर (+) JQ1 की उपस्थिति में BRD4 का रेफरेंस पैटर्न. ख) OVCA429 कोशिकाओं में DMSO नियंत्रण की तुलना में 1 µ मीटर (+) JQ1 की उपस्थिति में ARID1a का रेफरेंस प्रोफाइल । बैंड तीव्रता DMSO या (+) JQ1 के साथ 0 मिमी-५०० मिमी अंश के लिए संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: क्रोमेटिन landscaped है जब बाइंडिंग में परिवर्तन संशोधित किया गया है
क) OVCA429 कोशिकाओं से BRD4 रेफरेंस की तुलना १० µ एम साहा के साथ DMSO उपचार की तुलना में ३ घंटे के लिए की गई. ख) OVCA429 कोशिकाओं से ARID1a के रेफरेंस प्रोफाइल का इलाज with10 µ एम साहा की तुलना में DMSO. बैंड तीव्रता DMSO या साहा के साथ 0 मिमी-५०० मिमी अंश के लिए संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: डीएनए क्षति के बाद PBRM1 बाइंडिंग में परिवर्तन
1 µ m डॉक्सोरूबिसिन के साथ इलाज HEK293T कोशिकाओं से PBRM1 बाइंडिंग के लिए SSE परिणाम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

नमक के अर्क के माध्यम से प्रोटीन और क्रोमेटिन बातचीत का लक्षण वर्णन एक आम तरीका है कि दशकों के लिए नियोजित किया गया है14,15; हालांकि, इसकी पूरी उपयोगिता प्रकट करने से पहले इसे व्यवस्थित रूप से ऑप्टिमाइज़ नहीं किया गया है । हम प्रदर्शन कैसे इस अनुक्रमिक विधि एक तेजी से और सस्ती तरीका क्रोमेटिन बंधन में परिवर्तन भेद जब प्रोटीन या पर्यावरण बदल जाता है प्रदान करता है । SSE अत्यधिक अनुकूलनीय और optimizable है, और महत्वपूर्ण बात, यह तकनीकी रूप से सरल है और कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । महत्वपूर्ण पहलुओं है कि शुरू करने से पहले अनुकूलित किया जा करने की आवश्यकता है: शुरू सेल संख्या, hypotonic बफर शर्तों, और मशीन समय ।

कोशिका संख्या का सबसे महत्वपूर्ण पहलू यह है कि यह सभी नमूनों के बीच संगत है । जब बाफ परिसरों में देख, ८,०००,००० कोशिकाओं का उपयोग कर कैसे इन परिसरों बाध्यकारी है की एक अच्छी प्रोफ़ाइल देता है; हालांकि, कोशिकाओं की संख्या (या बफर की मात्रा) ब्याज की प्रोटीन की बहुतायत के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि कम कोशिकाओं का उपयोग कर रहा है क्योंकि ४०० mm और ५०० mm NaCl यह क्रोमेटिन गोली कल्पना मुश्किल है पर चुनौतीपूर्ण है । यह सुनिश्चित करें कि गोली ४०० mM NaCl के बाद supernatant के साथ स्थानांतरित नहीं है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है ।

आदेश में सही परमाणु प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए, नाभिक जब तक वे 0 mM NaCl mRipa समाधान के साथ लीजड रहे है बरकरार रहने की जरूरत है । कई सामांयतः इस्तेमाल किया hypotonic समाधान भी ऐसे HEK293T और हेला कोशिकाओं के रूप में सेल लाइनों के लिए कठोर हैं । इन कक्ष पंक्तियों के लिए, यह संशोधित बफ़र A का उपयोग करने के लिए अनुशंसित है ।

अंत में, मशीन समय प्रयोग के आधार पर भिंन हो सकते हैं । बाफ के लिए उपइकाई रेफरेंस पैटर्न एक 3 मिनट और 10 मिनट की मशीन के बीच नहीं बदलता है; हालांकि, PRC1 कॉम्प्लेक्स का रेफरेंस काफी बदलावों के आधार पर होता है कि नमूनों में कितनी देर तक गर्मी होती है । इसके अतिरिक्त, जब अपने लक्ष्य के बंधन पर एक अवरोधक के प्रभाव का मूल्यांकन, मशीन समय अवरोधक कैनेटीक्स के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है ।

जब प्रयोग प्रदर्शन, यह आवश्यक है के रूप में नमूनों के उपचार के साथ संभव के अनुरूप हो । प्रत्येक अंश के लिए, नमक बफर हर नमूने के लिए homogenization से पहले जोड़ा जाना चाहिए ताकि प्रत्येक नमूना समान रूप से सामने आ रहा है । pipetting की बात को तोड़ने के लिए क्रोमेटिन और मदद बाध्य प्रोटीन जारी है । यह सुनिश्चित करें कि गोली पिपेट टिप के माध्यम से गुजरता बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । विशेष रूप से जब कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का उपयोग कर, क्रोमेटिन गोली पिपेट टिप पहले कुछ समय के माध्यम से पारित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । हमने पाया है कि एक 1 मिलीलीटर टिप इस के लिए सबसे अच्छा काम करता है, माइक्रो केंद्रापसारक ट्यूब के नीचे के खिलाफ टिप के छोटे दोहन के साथ के रूप में, हम टिप में गोली आकर्षित करने में सक्षम हैं । टिप के माध्यम से पंद्रह बार क्रोमेटिन गोली गुजर के बाद, गोली सुचारू रूप से टिप के माध्यम से जाना चाहिए, हालांकि यह भंग नहीं होगा । बर्फ पर नमूनों की मशीन और केंद्रापसारक द्वारा क्रोमेटिन अलग करने के बाद, एक २०० µ एल पिपेट टिप के साथ supernatant को हटाने क्रोमेटिन गोली बाधित किए बिना अधिक से अधिक हटाने के लिए अनुमति देता है ।

हालांकि SSE तकनीकी निरंतरता की आवश्यकता है, यह सरल है, सीधा है, और आम प्रयोगशाला संसाधनों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । यह ध्यान रखें कि इस विधि की असली शक्ति है जब यह अंय phenotypical परीक्षाओं के साथ युग्मित है महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, इस तकनीक का उपयोग कर, हम PBRM1 के बंधन प्रोफाइल की तुलना में जब उसके छह bromodomains के प्रत्येक रूपांतरित हो गए थे, हम निर्धारित किया है कि सभी लेकिन bromodomains के एक PBRM1 के बंधन में शामिल करने के लिए डिग्री7बदलती हैं । साज़िश, हमने पाया कि bromodomains कि बाध्यकारी के लिए सबसे महत्वपूर्ण थे भी जीन अभिव्यक्ति और नियंत्रण सेल प्रसार के PBRM1 विनियमन के लिए आवश्यक7। हम भी मात्रात्मक चिप द्वारा एक असतत जीनोमिक लोकस करने के लिए इन म्यूटेंट के बंधन में परिवर्तन मान्य-qPCR7.

हम कैसे इस तकनीक प्रोटीन क्रोमेटिन बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की केवल कुछ उदाहरण दिखाया है; हालांकि, हमारी प्रयोगशाला में, हमने पाया है कि SSE क्रोमेटिन रीडर प्रोटीन के बारे में सवालों की एक विस्तृत सरणी की जांच के लिए एक बहुमुखी उपकरण है । अंय विश्लेषण के साथ संयोजन में, इस तकनीक हमारी क्षमता इन विस्तृत प्रोटीन परिसरों में शामिल घटकों की कार्यक्षमता स्पष्ट की सुविधा । व्यक्तिगत डोमेन के महत्व को समझने के द्वारा, हम पहचान सकते है कि वे एक अवरोध करनेवाला है कि ब्लॉक क्रोमेटिन एसोसिएशन के विकास के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्य हैं ।

हम प्रदर्शन किया है कैसे SSE को क्रोमेटिन के लिए बाध्यकारी प्रोटीन पर एक छोटे से अणु अवरोधक की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, epigenetic लेखकों और युगों को बाधित करके, SSE PTM स्तर और पाठक प्रोटीन के बीच संबंध निर्धारित कर सकते हैं । हम भी SSE इस तरह डीएनए क्षति के रूप में बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में बाध्यकारी में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दिखाया गया है । हालांकि यह एक सरल तकनीक है, जब उचित परिस्थितियों में लागू, यह बहुत क्रोमेटिन और उसके विनियामक प्रोटीन के हमारे ज्ञान अग्रिम कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों की कोई होड़ वित्तीय हितों की नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य के लिए वी फाउंडेशन से कैंसर अनुसंधान के लिए एक वी विद्वान पुरस्कार (V2014-004) और एक वी विद्वान प्लस पुरस्कार (D2016-030), और एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान अनुदान (ACS IRG अनुदान 58-006-53) द्वारा समर्थन किया गया इन्होने कैंसर के लिए विश्वविद्यालय केंद्र अनुसंधान. ई. जी. पी. इन्होने विश्वविद्यालय के औषधीय रसायन एवं आणविक औषध विज्ञान विभाग को Borch स्नातक बंदोबस्ती पुरस्कार से समर्थन दिया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) Avantor/Macron 7581-06
Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) Avantor/Macron 8360-04
Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) Avantor/Macron 6858-04
Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline Sigma-Aldrich T1503-1kg
EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) Avantor/Macron 4931-02
NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 Amresco E109-100ML
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-080
Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) Avantor/Macron 5958-04
GLYCEROL, 1L Amresco 0854-1L
DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g Amresco 0613-100G
Eppendorf Research plus pipette Fisher Scientific 13-690-032
Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge Eppendorf 5424 R
Secondary mouse IgG HRP-linked Cell Signaling 7076
Secondary rabbit IgG HRP-linked Cell Signaling 7074
BMI-1 antibody Millipore
PBRM1 antibody Bethyl A301-591A
ARID1a antibody Santa Cruz sc-32761
BRD4 antibody Bethyl A301-9852a
(+) JQ1 Cayman Chemical Company 11187
SAHA Cayman Chemical Company 10009929
Doxorubicin AK Scientific 25316-40-9
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Macron 4948-02
Mini Trans-Blot Cell BioRad 1703930
Mini Gel Tank ThermoFisher A25977
Albumin, Bovine (BSA) Amresco 0332-100g Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) Life Technologies B0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x) Life Technologies B0007
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa ThermoFisher 26619
Methyl Alcohol, Anhydrous Macron 3041-10
Trypsin kEDTA, 1X Cellgro 25-053-CI
SODIUM AZIDE, 250g UN1687 Amresco 0639-250G
SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 Amresco 0227-500G
Glycine,for electrophoresis, >=99% Sigma-Aldrich G8898-1kg
BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR 20170-333
1000 µL Pipet Tips VWR 83007-382
NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% Invitrogen NW04125BOX
Leupeptin Hemisulfate, 5 MG RPI Research Products 22035-0.005 Used for Protease inhibitor solution.
APROTININ, 10 MG RPI Research Products 20550-0.01 Used for Protease inhibitor solution.
PEPSTATIN A, 5 MG RPI Research Products 30100-0.005 Used for Protease inhibitor solution.
OVCA429 cells Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.
HEK293T ATCC CRL-3216
HeLa cells ATCC CCL-2
McCoy's 5A media Corning Mediatech 10-050-CV
DMEM Corning Mediatech 10-013-CV
Minimum Essential Medium (MEM), Powder Corning Mediatech 50-011-PC
MEM NEAA (100X) non-essential amino acid Gibco 11140-050
FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source Omega Scientific FB-11
Penicillin-Streptomycin Solution Life Technologies 15140-122
Glutamax Life Technologies 35050-061
sodium pyruvate Life Technologies 11360070
VWR Power Source VWR 13-690-032

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References

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जेनेटिक्स अंक १२८ क्रोमेटिन अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण क्रोमेटिन remodeling परिसरों बाध्यकारी प्रोफाइल epigenetics citrullinated मार्क्स citrullinated मांयता डोमेन SWI/SNF Polybromo-1
क्रोमेटिन को संशोधित करने के थोक क्रोमेटिन बाइंडिंग गुणों के विश्लेषण के लिए अनुक्रमिक नमक निकालने के परिसरों
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Porter, E. G., Connelly, K. E., Dykhuizen, E. C. Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes. J. Vis. Exp. (128), e55369, doi:10.3791/55369 (2017).

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