Rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als Biowires gebruiken elektrische stimulatie

Summary

De cardiale biowire platform is een in vitro werkwijze toegepast om menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CM) rijpen combineert driedimensionale celkweek elektrische stimulatie. Dit handschrift bevat de gedetailleerde opzet van de cardiale biowire platform.

Abstract

Human pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CMS) hebben een veelbelovende bron van cellen geweest en hebben dus moedigde het onderzoek naar hun potentiële toepassingen in cardiale onderzoek, met inbegrip van de ontdekking van geneesmiddelen, de ziekte van modellering, tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Cellen die door bestaande protocollen geven een reeks onrijpheid vergeleken met natief volwassen ventriculaire hartspiercellen. Vele pogingen zijn gedaan om te rijpen HPSC-CM's, met slechts een matige rijping tot nu toe bereikt. Daarom is een ontworpen systeem, genaamd biowire is bedacht door zowel fysische en elektrische signalen leiden HPSC-CM naar volwassen toestand vitro. Het systeem gebruikt een microfabricated platform HPSC-CM zaad collageen type I gel langs een stijve matrijs hechtdraad assembleren tot uitgelijnde hartweefsel (biowire), die wordt onderworpen aan elektrisch veld stimulering met een progressief toenemende frequentie. Vergeleken met niet gestimuleerde controlesbiowired gestimuleerde cardiomyocyten vertonen een verhoogde mate van structurele en elektrofysiologische rijping. Dergelijke veranderingen zijn afhankelijk van de stimulatiefrequentie. Dit manuscript beschrijft in detail de ontwerpen en maken van biowires.

Introduction

Cel-gebaseerde therapie is een van de meest veelbelovende en onderzocht strategieën om cardiale reparatie / regeneratie te bereiken. Het is geholpen door hartweefsel engineering en co-afgifte van biomaterialen ^{1, 2.} De meeste beschikbare bronnen van cellen zijn onderzocht in diermodellen voor hun mogelijk gunstige effecten op beschadigde, zieke of oude harten ^3. In het bijzonder zijn aanzienlijke inspanningen gedaan om pluripotente stamcellen humaan gebruik (HPSC) afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CM), een potentieel onbeperkte bron van autologe cellen voor cardiale tissue engineering. HPSC-CM's kunnen worden geproduceerd met behulp van verschillende vastgestelde protocollen ^{4, 5, 6.} De verkregen cellen vertonen foetaal-achtige fenotypen met verschillende onvolwassen kenmerken in vergelijking met volwassen ventriculaire hartspiercellen ^7, </sup> ^8. Dit kan een belemmering vormen voor de toepassing van HPSC-CM's als modellen van volwassen hartweefsel in drug discovery onderzoek en in de ontwikkeling van volwassen hartziekten modellen ⁹ zijn.

Om deze beperking van de fenotypische onvolwassenheid te overwinnen, zijn nieuwe benaderingen actief onderzocht om cardiomyocyt rijping te promoten. Vroege studies toonden effectieve pro-rijping eigenschappen in neonatale cardiomyocyten van de rat via cyclische mechanische of elektrische ¹⁰ stimulatie ^11. Gel verdichting en cyclische mechanische stimulatie werd ook aangetoond dat bepaalde aspecten van HPSC-CM maturatie ^{12, 13,} met een minimale verhoging van de elektrofysiologische en calcium hanteringseigenschappen te verbeteren. Daarom is een platformsysteem genaamd "biologische wire" (biowire) werd ontwikkeld door zowel structurele signalen en elektrisch veld stimulatien de rijping van HPSC-CM ¹⁴ verbeteren. Dit systeem gebruikt een microfabricated platform gericht cardiaal weefsel dat geschikt is voor elektrisch veld stimulering te creëren. Dit kan worden gebruikt om de structurele en elektrofysiologische looptijd HPSC-CM verbeteren. Hier beschrijven we de details van het maken van dergelijke biowires.

Protocol

1. Master ontwerp en de fabricage OPMERKING: Gebruik een zachte lithografie voor fabricage van de inrichting. Maak een tweelaags SU-8 meester voor polydimethylsiloxaan (PDMS) gieten. Ontwerp het apparaat met een ontwerp en conceptsoftware (Figuur 1A, links). Trekken elke laag van de master gescheiden. Druk het ontwerp apparaat twee fotomaskers bij 20.000 dpi, overeenkomen met de twee lagen van de master 15. Stel de inrichtingpatroon doorzic…

Representative Results

De rationeel gebruik van een hechting in de biowires moet dienen als een matrijs voor het vormen van 3D-constructen die aansluiten op één as en bootsen de vorm van cardiale vezels. We tonen aan dat na zeven dagen van de cultuur in de biowire, cellen gerenoveerd de gel rond de hechtdraad (Figuur 3A). De cellen samengevoegd langs de as van de hechtdraad vormen uitgelijnde hartweefsel (figuur 3). Na 7 dagen voorkweek werden de biowires onderworpen aan 7 d…

Discussion

Dit manuscript beschrijft de opzet en uitvoering van de gemanipuleerde platform, biowire, om de rijping van HPSC-CM's te verbeteren. De inrichting kan worden vervaardigd in standaard microfabricage faciliteiten en biowires kunnen worden met gemeenschappelijke celkweek technieken en een elektrische stimulator.

Voor zover wij weten, is er geen methode gerapporteerd vergelijkbaar met biowires. Deze strategie blijkt dat een betere rijping eigenschappen waren afhankelijk van de elektrische st…

Materials

L-Ascorbic acid	Sigma	A-4544	hPSC-CM culture media componet
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm			Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail	BD Biosciences	354249	Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I	Sigma	C0130	0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm)	Dremel		Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator	Grass	s88x
Fetal bovine serum (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767	Collagen gel component
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES	Sigma	H4034	Collagen gel component
Hot plate	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Mask aligner	EVG	EVG 620
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230	Collagen gel component
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11150059	Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker	VWR	89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14040133
Plate (6-well)	Corning	353046
Plate (6-well), low attachment	Corning	3471
Platinum wires, 0.2 mm			Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		To develop the wafer
Pouch, peel-open	Convertors	92308	For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch	UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761	Collagen gel component
Sodium hydroxide	Sigma	S8045	Collagen gel component
Sprin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
StemPro-34 culture medium	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media			Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		photoresist, master component
SU-8 2050	MicroChem Corp.		photoresist, master component
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM culture media componet
Wash medium			IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin