Maturação de cardiomiócitos estaminais humanas derivadas de células em Biowires Usando Electrical Stimulation

Resumo

A plataforma biowire cardíaca é um método in vitro utilizado para amadurecer embrionário humano e cardiomiócitos derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (HPSC-CM) através da combinação de cultura de células tridimensional com estimulação eléctrica. Este manuscrito apresenta a configuração detalhada da plataforma biowire cardíaca.

Resumo

cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC-CMS) têm sido uma fonte de células promissor e, assim, encorajados a investigação de suas possíveis aplicações na pesquisa cardíaca, incluindo a descoberta de medicamentos, modelagem de doença, a engenharia de tecidos e medicina regenerativa. No entanto, as células produzidas por protocolos existentes exibir uma gama de imaturidade comparado com cardiomiócitos ventriculares adulto nativas. Muitos esforços têm sido feitos para amadurecer HPSC-CMs, com apenas maturação moderada alcançado até agora. Portanto, um sistema de engenharia, chamado biowire, foi concebida, fornecendo pistas tanto físicas e eléctricas para levar HPSC-MC para um estado mais maduro in vitro. O sistema utiliza uma plataforma microfabricado para semear HPSC-CMs em colagénio do tipo I gel ao longo de um fio de sutura molde rígido para montar em tecido cardíaco alinhados (biowire), que é submetido a estimulação do campo eléctrico com uma frequência progressivamente crescente. Em comparação com os controlos não estimulados,estimulada biowired cardiomiócitos exibem um maior grau de maturação estrutural e electrofisiológica. Tais alterações são dependentes da taxa de estimulação. Este manuscrito descreve em detalhe a concepção e criação de biowires.

Introdução

terapia baseada em celular é uma das mais promissoras e investigados para alcançar cardíaca reparação / regeneração. Ele foi auxiliado por engenharia de tecidos cardíaco e o co-entrega de biomateriais ^{1, 2.} A maioria das fontes celulares disponíveis têm sido estudados em modelos animais para os seus efeitos potencialmente benéficos sobre danificados, doentes, ou corações com idades entre ^3. Em particular, os esforços significativos foram feitos para usar células-tronco pluripotentes humanas (HPSC) derivada de cardiomiócitos (HPSC-CM), uma fonte de células autólogas potencialmente ilimi....

Protocolo

1. Projeto mestre e fabricação

NOTA: Use litografia suave para a fabricação do dispositivo. Faça um mestre SU-8 de duas camadas para a moldagem de polidimetilsiloxano (PDMS).

1. Desenhe o dispositivo usando um software de desenho e desenho ( Figura 1A , à esquerda). Desenhe cada camada do mestre separadamente. Imprima o desenho do dispositivo em duas fotomassagens a 20.000 dpi, correspondendo às duas camadas do mestre ¹⁵ . Definir o padrão do dispositivo como transparente ea área circundante como escuro; As máscaras servem como molde para transferir opticamente o padrão de dispositivo para ....

Resultados

O racional para o uso de uma sutura no biowires é servir como um molde para a formação de construções 3D que se alinham em um eixo e imitam a forma de fibras cardíacas. Mostramos que após sete dias de cultura no biowire, as células remodelaram o gel ao redor da sutura ( Figura 3A ). As células foram montadas ao longo do eixo da sutura para formar o tecido cardíaco alinhado ( Figura 3 ). Após 7 dias de pré-cultura, os biowires foram submetidos a 7 dias de.......

Discussão

Este manuscrito descreve a configuração e a implementação da plataforma de engenharia, biowire, para melhorar a maturao de HPSC-CMs. O dispositivo pode ser feito em instalações de microfabricação padrão, e biowires pode ser produzido com técnicas de cultura de células comuns e um estimulador elétrico.

Para nosso conhecimento, não há nenhum método relatado semelhante ao biowires. Esta estratégia revela que a melhoria das propriedades de maturação foram dependentes do regime de estimulação elé.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido L-ascórbico	Sigma	A-4544	hPSC-CM composto de meios de cultura
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software para projetar dispositivo
Hastes de carbono, Ø 3 mm			Componente da câmara do estimulador elétrico
Colágeno, tipo 1, cauda de rato	BD Biosciences	354249	Gel de colágeno: 2,1 mg/mL de colágeno de cauda de rato tipo I em 24,9 mM de glicose, 23,8 mM de NaHCO3, 14,3 mM de NaOH, 10 mM de HEPES, em 1x meio M199 com 10% de Matrigel reduzido por fator de crescimento.
Colagenase tipo I	Sigma	C0130	0,2% colagenase tipo I (p/v) e 20% FBS (v/v) em PBS com Ca2+ e Mg2+. Esterilize com 0,22 μ m filtrar e fazer alíquotas de 12 mL. Armazene a -20 ° C.
Desoxirribonuclease I (DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	Faça 1 mg/mL de solução de estoque de DNase I em água. Filtre estéril e armazene alíquotas de 0,5 mL em − 20 ° C
Broca e brocas (Ø 1 mm e 2 mm)	Dremel		Faça furos em armações de policarbonato
Estimulador elétrico	Grass	s88x
Soro bovino fetal (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glicose	Sigma	G5767	Componente de gel de colágeno
L-Glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ · cm em 25 &graus; C, ultrapuro, para fazer todas as soluções
HEPES	Sigma	H4034	Componente de gel de colágeno
Placa quente	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
Máscara alinhadora	EVG	EVG 620
Matrigel, fator de crescimento reduzido	Corning	354230	Componente do gel de colágeno
Medium 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11825015	Componente do gel de colágeno
Monotioglicerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM composto de meio de cultura
Agitador orbital	VWR	89032-088
Penicilina/Estreptomicina (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Ca2+ e Mg2+	de 14040133		Thermo Fisher
Scientific (6 poços)	de 353046		Corning
(6 poços), baixa fixação	Corning	3471
Fios de platina, 0,2 mm			Componente da câmara do estimulador elétrico
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Éter monometílico de propilenoglicol acetato (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		Para desenvolver a bolsa de wafer
, conversores de abertura		92308	para esterilização a vapor
Wafer de silício, 4 polegadas	UniversityWafer Inc.
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma	S5761	Componente do gel
de colágeno Hidróxido de sódio	Sigma	S8045	Componente do gel de colágeno
Revestidor de sprin	Sistemas de revestimento especiais	G3P-8
Meio de cultura StemPro-34	Thermo Fisher Scientific	10639011	Meio de cultura hPSC-CM. Para fazer 50 mL, adicione 1,3 mL de suplemento, 500 μ L de 100 vezes; L-Glutamina, 250 μ L de 30 mg/mL de transferrina, 500 μ l de 5 mg/mL de ácido ascórbico, 150 μ L de 26 μ l /2 mL de monotioglicerol (MTG) e 500 μ L (1 %) penicilina/estreptomicina.
Meio			Meio de lavagem:FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		fotorresistente, componente mestre
SU-8 2050	MicroChem Corp.		fotorresistente, componente mestre
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM composto de meios de cultura
Tripsina / EDTA, 0,25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	composto de meios de cultura hPSC-CM
Meio			IMDM contendo 1% de penicilina / estreptomicina

Placa Placa de parada de lavagem