Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Published: March 8, 2018 doi: 10.3791/55440
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Nuclear Medicine and Radiobiology, Université de Sherbrooke, 2Sherbrooke Molecular Imaging Center (CIMS), Université de Sherbrooke, 3Sherbrooke Institute of Pharmacology

Summary

Antikor-conjugates için (ACs) birleştiğinde Viral kaynaklı peptidler, moleküler yükleri artan tümör hücre birikmesi ile teslim etme potansiyeli nedeniyle ivme kazanıyor bir yaklaşım var. Peptid konjügasyon, AC ve hücre içi yük birikimi ve tümör hedefleme değerlendirmek için ortak yöntemleri kullanarak, bu protokolü anahtar ilk geliştirme aşamalarında araştırmacılar yardımcı olur.

Abstract

Antikor-virüs kaynaklı peptidler ile modifiye conjugates (ACs) tümör hücre teslimat maddeleri, kanser tedavisinde kullanılan ve artan hücresel birikimi nedeniyle üzerinde geçerli ACs Imaging moleküler yükleri için potansiyel olarak güçlü bir sınıfıdır. Sırasında erken AC vitro geliştirme, Floresans teknikleri ve radioimmunoassays hücre içi yerelleştirme, birikimi verimlilik ve hedef hücre özgüllük belirlemek için yeterlidir. Şu anda, hücreleri AC hücre içi birikimi ve yerelleştirme değerlendirmek için hazırlanması için standart yöntemleri üzerinde hiçbir fikir birliği yoktur. Özellikle birkaç aday inşa edilmiştir Eğer virüs kaynaklı peptidler ile modifiye ACs ilk test önemlidir. Hücre içi birikimi Floresans tarafından belirlenmesi ACs arka plan sinyalini hücre yüzeyinde tarafından etkilenen ve birikimi yorumlanması karmaşık. Radioimmunoassays, genellikle tedavi hücreleri şeker ve farklı hücre bölmeleri radyoaktivite ölçülür. Ancak, hücre hücre hücre lizis değişir ve genellikle nükleer ve sitoplazmik bölmeleri yeterince izole değildir. Bu yanıltıcı veri yükü teslim özellikleri oluşturabilir. Radiolabeled virüs kaynaklı peptid-modified ACs radyonüklid görüntüleme tarafından izledi farelerin taşıyan tümör olarak intravenöz enjeksiyon vivo içinde aşamasında tümör hedefleme ve yükü teslim özelliklerinin belirlenmesi için güçlü bir yöntemdir geliştirme. Ancak, bu görece yeni bir ilerleme ve birkaç gruplar virüs kaynaklı peptid-modified ACs bu şekilde değerlendirdi. Peptid-modified AC birikimi virüs kaynaklı confocal mikroskobu ve radioimmunoassays kullanırken daha doğru bir şekilde değerlendirmek için işlem görmüş hücreleri işlenmesi açıklayın. Özellikle, hücre yüzeyine kaldırmak trypsinizing hücreler için bir yöntem ACs bağlı. Ayrıca hücresel ayırma geliştirmek için bir yöntem sağlar. Son olarak, bu protokolü ilk tümör tümör taşıyan farelerde özellikleri hedefleme değerlendirmek için Pozitron emisyon tomografisi (PET) kullanarak bir vivo içinde yöntemi sağlar. Radyoizotop 64Cu kullandığımız (t1/2 = 12,7 h) olarak bu iletişim kuralı bir örnek yükünde.

Introduction

Antikor-conjugates (ACs) etkili ilaçlar kanser tedavileri geliştirmek için ve tümör tespit için dönüştürücü bir sınıfının içine olgunlaşması Biyofarmasötikler vardır. Monoklonal radioisotopes, küçük moleküller ve biyolojik toksinler gibi moleküler yükleri için Birleşik antikor (mAb) oluşur, ACs bu yükleri kanser hücrelerinin enfes hedef antijen benzeşme ve özgüllük ile teslim etmek mümkün. Böylece ACs olasılığını önemli ölçüde nonspesifik toksisite azaltmak ve tümör sitesinde yükü aktivite artışı var. Tedavi amaçlı, sitotoksik küçük moleküller (antikor-uyuşturucu conjugates olarak yaygın olarak anılacaktır) taşıma ACs geleneksel tedaviler 1, başarısız olduğu hastalarda meme kanseri ve Hodgkin Lenfoma tedavisi için onaylanmıştır 2. Ayrıca, ACs taşıma radioisotopes (genellikle radioimmunoconjugates adlandırılır) de geliştirme aşamasındadır. Radyoizotop görüntüleme için taşıma bir AC prostat kanseri metastaz 3tanımlamak için onaylanmıştır. Onay 4için gönderilmiş pek çok daha fazla terapötik ACs ile iyimserlik ACs kanser bakımı 5geliştirmek için gelecek için yüksektir.

Yine de, chemotherapeutics veya radioisotopes teslim edilirken, etkili bir şekilde bu yüklerini hedef hücreleri içinde biriken zorluk ACs yok. Bu açıdan önemli ölçüde uzun ömürlü hastalıksız sağkalım veya yüksek karşıtlık tümör 6,7görüntüleme sağlamak için ACs yetersizlik içinde birçok durumda da katkıda bulunur. ACs bağlamak sonra onların hedef antijen genel olarak, onlar reseptör aracılı endositoz bilinen işlem aracılığıyla içselleştirilmiş. ACs sonra endosomes içinde entrapped ve organellerin bozulması için insan ticareti ve yükü bırakın 8. Hücre içi ticaret işleminin ACs yüksek yük özgüllük ve hedef kanser hücrelerine karşı etkinlik elde etmek için sorunlar teşkil etmektedir. Örneğin, birçok antijenleri Her2 gibi (hedef için tedavi AC Trastuzumab-emtansine) ilk 30 dk 9ilişkili antikorlar % 85 kadar geri dönüşüm. Bir kez bozulması oluşur, Ayrıca, yayımlanan chemotherapeutics ve radioisotopes aktif olarak artan ifade ve/veya ilişkili membran transport proteinleri 10,11etkinlik tarafından verilebilir. Lysosome bozulması da tedavi enzimler gibi roman biyolojik payloads teslimini engelleyen ve -ebilmek var olmak oligonucleotides 12,13devre dışı. Aslında, kanser hücresi ACs tarafından teslim payloads hücre içi gerekli birikimi abrogating son derece etkili olduğunu.

Bu iletişim kuralı için özellikle endosome tuzak kaçan ve hücre çekirdeği yerelleştirme için virüs kaynaklı peptidler ACs birleştiğinde kavramını uygulamak açıklar. Konak hücre sistemleri işlemek için böyle sofistike ile bu virüs kaynaklı proteinler ve peptidler geliştirilmesi olarak potansiyel Biyofarmasötikler uzun tedavi araştırma 14' te kökleşmiş olduğunu şaşırtıcı değil. Milyonlarca yıldır virüs proteinleri normal fizyolojik memeli hücre sistemleri etkili konak hücreleri girmek için açığından olağanüstü bir topluluğu elde etmek için evrim geçirmiş. Reseptör aracılı endositoz ile içselleştirilmiş virüsler, onlar da lysosome için ticareti nerede proteaz yerelleştirilmiş bir konsantrasyon bir saldırı hayatta kalmak için sorunlu olabilir kaçan ile zorlanmaktadır. İlaç dağıtım endosome tuzak kaçan kullanıldığında iyi karakterize viral kaynaklı peptid transkripsiyon (Tat) protein 15insan immün yetmezlik virüsü transactivator var. Tat endosome tuzak düşük pH bu noktada protein konformasyon kendi içine yerleştirin ve endosomal membran 16bozmak için etkinleştirme Tat değişikliklerden algılama tarafından kaçmak yapabiliyor. Bu Tat-yükü conjugates sitoplazma erişmek mümkün olur. Bu iletişim kuralı ile ilgili ikinci viral manipülasyon öğe tedavi genler ve uyuşturucu çekirdeği 17' ye teslim etmek için kullanılan yaklaşımdır. Virüs başarıyla nükleer membran nükleer gözenek karmaşık (NPC) iletmek yoluyla ilerleme için konak hücre makine işlemek için evrim geçirmiş. Hücresel oluştururlar (veya içeren bağlama içeren proteinler) nükleer yerelleştirme sinyalleri (NLSs) için nükleer bağlama için gerekli taşıma NPC ile gerekli hareketleri sağlayan proteinler (örneğin karyopherins α ve β). Virüs proteinleri konak hücre taşıma proteinleri çekirdeği 18mekik için kullanma özelliğini ile bunları sağlamak NLS sıraları içerir geliştirdik.

Çok sayıda ACs daha önce Tat ve NLS türetilmiş peptidler ile functionalized edilmiş ve kanser hücrelerinin içinde birikir yeteneğini ve tümör 19,20,21,22 hedefleme için test ,23,24,25,26,27,28,29,30 (Tablo 1). Sitotoksik yükleri teslim çalışmalar virüs kaynaklı peptidler ile modifiye ACs hücresel birikimi, sitotoksisite ve değiştirilmemiş ACs 22,26üzerinde öldürmek tümör önemli ölçüde artırabilirsiniz gösterdi. AC roman bu sınıf için ortak bir özelliği onların yapıdır. Genellikle, peptidler ücretsiz sulfhydryl Grup sağlayan bir terminal sistein içerir. MAbs N- hydroxysuccinimide (NHS) ve ters ucunda maleimide grupları içeren bir noncleavable bifonksiyonel crosslinker ile ilk tepki. NHS esterleri mAb Amid bağı oluşturmak için Birincil aminler ile tepki. Ücretsiz maleimide grupları ile tepki mAb sonra bir thioester bağ ve böylece peptid ve mAb bağlantı oluşturmak üzere peptitler üzerinde sulfhydryl gruplarıyla tepki. Homobifunctional crosslinkers kullanılan 28olmasına rağmen heterobifunctional crosslinker daha yaygın olarak virüs kaynaklı peptid-ACs 22,23,26yapımında kullanılan, 31,32. Bu iletişim kuralı, özellikle crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) kullanıyor Siklokekzan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) için kullanım kolaylığı ve onaylanmış antikor-uyuşturucu eşlenik Trastuzumab-emtansine ve birçok kullanıldığından virüs kaynaklı peptid-ACs 8,22,23,26,31,32. Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) olduğunu ve başlangıçta konjugasyon verimliliği belirlemek için birincil yöntem yarı sayısal peptidler mAb başına sayısı. Confocal mikroskobu bir fluorescently etiketli ikincil antikor mAb için belirli kullanarak genellikle başlangıçta peptid-modified ACs virüs kaynaklı hücre içi dağıtım özelliklerini değerlendirmek için yöntemidir. Şimdiye kadar radioisotopes virüs kaynaklı peptid-modified ACS'nin teslim birincil yük vardır. Radioisotopes avantajlı olduklarından radyoaktivite hücrelere kolayca gama sayarak sayılabilir. Buna ek olarak, insan kanser fare modelleri içine çevrilir ACs sağlamak araştırmacılar yeteneği ile tümör gibi tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi ve Pozitron emisyon tomografisi (PET) moleküler görüntüleme yöntemleri kullanarak hedefleme değerlendirmek 23 , 32 , 33. genel olarak, inşaat ve doğrulama testi öncelikle araştırmacılar tarafından kullanılan yöntemleri etkili biçimde girin ve teslim ACs virüs kaynaklı peptidler ile ilk geliştirme aşamasında değiştiren çok iyi bir değerlendirme sağlar yükü hedef hücrelere ve hedef tümörler için.

Tat - ve NLS-modified ACs daha fazla yükü teslim kanser hücreleri içinde ve tümörleri için geliştirmek için ışıklı anahtar alanları vardır. NLS-modified ACs ile ilgili hücre içi birikimi verimliliği mütevazı 23,31,34olabilir. Verimsiz hücre içi birikimi devam endosomal tuzak tarafından nedeniyle oluşur. Vivo tümör hedefleme de her iki Tat - ve NLS-Modifiye ile ACs azalmış. Tat ve NLS etkin dizileri birkaç olumlu şarj edilmiş kalıntıları içerir. MAbs için bağlı, genel olarak Katyonik ücret önemli ölçüde artış 35olabilir. Sonuç olarak, Tat - ve NLS-modified ACs sağlıklı dokulara anlamazdın arttı ve hızlı kan izni arttı.

Grubumuza bir bileşik bileşik geliştirilen kolik asit NLS (ChAcNLS; bağlı oluşan Şekil 1). ChAcNLS-modified ACs hücre içi teslim edilen radioisotopes birikimi artırmak ve tümör için NLS değiştirilme tarihi ve geleneksel ACs 33,34göre hedefleme geliştirmek mümkün. Kolik asit arkasında mekanizması kolik asit endosome kaçış ceramide oluşumu ile tetiklemek için kullanmak için membran füzyon üzerinde güvenemez select nonenveloped virüslerin yetenek esinlenmiştir. Örneğin, domuz enterik virüs ceramide 36,37,38sphingomyelin hidroliz tromboksan sphingomyelinase etkinleştirir kolik asit acemi. Bu endosomal membran oynattığını ve virüs'ün dışarı için sağlar. Böylece, kolik asit NLS tamamlayan başka bir virüs kaynaklı bileşenidir.

Bu alan ileri ve gelecek hareket ederken gelişmeler ortaya yükü teslim virüs kaynaklı peptidler ile modifiye ACs tarafından biyokimyasal ve fonksiyonel özellikleri visual gösteriler sırasında ilk geliştirme sağlamak için uygun bir zaman. Burada, virüs kaynaklı peptid-modified ACs hücre içi birikimi ve tümör erken sahne gelişimi sırasında hedefleme verimli ancak basit tespiti için ilk değerlendirilmesi için bizim Protokolü açıklar. Biz piyasada bulunan mAbs 7 g 3 ve A14 örnek model sistemleri olarak kullanın. Yordam 1 SDS-sayfa ' go/Hayır git' kararlar inşa ACs için izin veren bir yöntem olarak açıklar. Yordam 2 AC hücre içi dağıtım ve birikimi geliştirilmiş görselleştirme için izin trypsinization kullanarak bir yöntem açıklanır. Yordam 3 doğru nükleer yerelleştirme belirlemek gelişmiş hücre içi ayırma için bir yöntemi açıklar. Bu yordamda biz yükü 64Cu kullanmaktadır (t1/2 = 12,7 h) çünkü için hücresel sızma savunmasız ve Pozitron emitör 10numara. Böylece, yordam 4 vivo içinde tümör tümör alımını arka plan (Yani nontarget sağlıklı dokulara) göre görselleştirmek ve örnek AC özellikle ve etkili olabilir belirlemek için evde beslenen hayvan görüntüleme karakterizasyonu hedefleme açıklar Hedef tümörler. Bu yöntemlerin daha fazla ilerleme için adayları belirlemek için ACs virüs kaynaklı peptidler ile değiştirilmiş geliştirme araştırmacılar için yeterlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Açıklanan in vivo hayvan deneyleri bir onaylanmış protokolüne göre ve merkezi Hospitalier Universitaire de Sherbrooke Etik Komitesi için hayvan deneyleri Etik kurallar altında yapıldı.

1. antikor peptid konjugasyon

Not: ChAcNLS herhangi bir ticari peptid üretici veya üniversite bağlı peptid sentez bir hizmet platformu sentez. ChAcNLS sentezi başvuru 34bulunabilir. Yordamlar 1 ve 2 için 7 g 3, mAb lösemi antijen IL-3Rα 39için belirli olan kullanın.

  1. 1.7 mL microcentrifuge tüp bir 10 mg/mL (~ 1 mg toplam antikor) çözüm 7 g 3 fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7,6 olarak hazırlayın.
  2. Sulfo-SMCC Dimetil sülfoksit (DMSO), 5-10 mM bir konsantrasyon içinde çözülür. Vortexing çözüm iyice tam çözülme elde etmek için en iyi çalışır.
  3. 7 g 3 içeren tüp (genellikle arasında sulfo-SMCC-için - 7 g istenen 3'ün molar oranı bağlı olarak 5-20 μL) çözünmüş sulfo-SMCC çözüm ekleyin. Sulfo-SMCC-- 7 g-3 oranları 10, 25 ve 50 1 test tavsiye edilir. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  4. Arındırmak ve PBS pH 7,0 Ultrafiltrasyon aygıt ve tampon exchange kullanarak maleimide derivatized 7 g 3 konsantre. Yaklaşık 5 dk. atma akışı ve PBS, pH 7,0 ve santrifüj ile doldurmak için 8000 x g de tekrar santrifüj kapasitesi.
    1. Bu 7 - 8 kez gerçekleştirmek tamamen arabellek değişimi için. Filtre cihaz yerleştirerek baş aşağı bir temiz microcentrifuge tüp içinde yeniden elde etmek konsantre 7 g 3 protein. 1000 x g. kurtarma birimi, 2 dk santrifüj yaklaşık 0.3 mL olmalıdır
  5. Maleimide-harekete geçirmek 7 g 3 içeren tüp ChAcNLS logosuna 2 kat molar fazlalığı önceki adımda kullanılan sulfo-SMCC-- 7 g-3 oranı göreli olarak ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya Örneğin, bir 10-1 sulfo-SMCC-- 7 g-3 oranı kullandıysanız, 1'e 20 ChAcNLS-- 7 g-3 oranı kullanın. Toplam hacim önemli ölçüde değiştirilmemelidir.
    Not: ChAcNLS yağış konjugasyon işlemi sırasında neden olmaz, ancak bu diğer peptidler ile meydana gelebilecek bir olasılık olduğunu. Tüp yağış, peptidler hidrofobik olduğunda hangi büyük olasılıkla neden işaretleri için reaksiyonu sırasında gözlemlemek. Bu gibi durumlarda artan hydrophilicity sağlamak için değişiklikleri tasarlamak için peptid ilgi yeniden ziyaret değer olabilir.
  6. 7 G 3-ChAcNLS bir Ultrafiltrasyon cihaz istenen konsantrasyon ve arabellek Exchange PBS pH 7,4 (bkz. Adım 1.4) kullanarak konsantre. Toplam protein kurtarma verim ≥ olmalıdır orijinal başlangıç materyali % 75'i.
  7. SDS-sayfa (yeterli ChAcNLS ayrılması ağır Birleşik ve nonconjugated zincirleri zincirlerinden ışık sağlar) bir % 12 polyacrylamide jel kullanarak inşa 7 G 3-ChAcNLS adayları değerlendirmek için gerçekleştirin. Mix 10 μg 7G 3-ChAcNLS yükleme sayfasında, arabellek içeren 2 μL β-mercaptoethanol ve kuyunun içine yükleyin.
  8. Uygun voltaj (120 V % 12 jel için 1 h için) ayarlamak ve Elektroforez çalıştırın. Coomassie boya açık jel sonuna ulaştığında Elektroforez durdurmak.
    Not: jel çalıştırmak Coomassie boya ön izin vermeyin.
  9. Jel Elektroforez cihazları kaldır ve % 10 v/v buzul Asetik asit ve % 20 v/v metanol, içeren çözüm destaining ile durulayın.
  10. Jel fotoğrafını çekin ve bir cetvel ve ölçü birimi ile uzaklığı (cm) standartları ve 7 g 3 için conjugates göç. Saklama faktör (Rf) değeri hesaplamak mesafe olduğu bölünmüş (düşük protein Coomassie geçiş önüne yüklendiği) jel boy farkla göç. Rf değerleri her protein standart'karşı günlüğünde molekül ağırlığı (MW) arsa ve 7 g 3 boyutunu tahmin conjugates.
  11. Conjugates ve 7 g 3 1768.5 g tarafından/mol (ChAcNLS MW) değiştirilmemiş peptidler MW 7 g 3 arasındaki farkı bölünerek antikor başına sayısını hesaplayın.
  12. Dijital görüntü Coomassie lekeli jel al ve Dansitometresi çözümlemesi gerçekleştirin. Bu noktada, bir kurşun aday seçimi önemli toplama türü içermeyen sayısının ChAcNLS molekülleri ile AC temel alabilir.

2. confocal mikroskobu hücre içi birikimi değerlendirme için

Not: Hücre içi formülasyonları ile ilgi bir yük geliştirme önce peptid-modified mAbs birikimi hücre selectivity test etmek önemlidir. Çünkü tat da nonspesifik hücre penetrasyon için bir eğilimi var olduğu gösterilmiştir, ilk çözümlenirken hücre içi birikimi ve hücre seçicilik girişim pahalı geliştirme adımları pahalı yükleri ile önce değer. Bu nedenle, yordam 1 de izotip belirli konu dışı denetim mAbs değiştirmeniz gerekir. Protokol geri kalanı için antikor başına 10 ChAcNLS molekülleri ile olarak ACs ile çalışacaktır. Yordamlar 2 ve 3 için önemli adımlar da dahil olmak üzere bir şematik Şekil 2' de anlatılan.

Dikkat: Bu adım Protokolü işleme ve paraformaldehyde manipülasyonu içerir. Lütfen işlerken üreticinin yönergelerini izleyin.

  1. Hedef TF-1a hücreleri 200 nM 7G 3-ChAcNLS de dahil olmak üzere modifiye kontrol mAbs ile tedavi. 5 x 106 antijen pozitif hücreler ile conjugates 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
  2. 1 h sonra süpernatant kaldırmak ve buz gibi PBS 3 x 1 mL ile yıkayın. Taze medya ekleyin ve 37 ° C'de ek bir saatliğine kuluçkaya
  3. Ek saat sonra süpernatant kaldırmak ve 3 x 1 mL buz gibi PBS içinde yıkayın. % 0.25 tripsin ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren PBS 0.5 mL 3 up için 37 ° C'de 30 dk için ekleyin.
    Not: ilk pilot test sırasında bu hücreleri AC hücre içi birikimi farklılıkları belirlemek için trypsinize değil önerilir. Bu iletişim kuralı tripsin kullanımı teşvik ve biz nasıl bu hücre içi birikimi verimliliği farklı AC adayların değerlendirilmesi artırır göstermek.
    1. Kuluçka için farklı zamanlarda kesildi tüm hücreler için görsel olarak kontrol ederek sınayın. Buna ek olarak, hücre aliquots çözümleri boyama canlılık ile kuluçkaya ve akış sitometrik analiz yukarıda açıklanan 40olarak gerçekleştirin.
    2. Tripsin hücre kültürü RPMI 1640 media/10% fetal sığır serum 1,5 mL ile etkisiz hale getirin. 500 x g 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 3 x 0.5 mL buz gibi PBS içinde yıkayın.
  4. 0.5 mL PBS %1 paraformaldehyde ve % 1 Sükroz 30 dk. yıkama için buzda içeren hücrelerde düzeltme hücreleri 3 x 0.5 mL buz gibi PBS ve 5 dk. Permeabilize için 250 x g, santrifüj 0.5 mL % 0.15 içeren PBS Triton X-100 buz üzerinde 5 min için hücreleri. Buz gibi PBS hücrelerde yıkama ve aralıklarla tekrarlayın.
  5. 0.1 mL PBS 2 μg/mL (veya üreticinin konsantrasyon önerilir) içeren hücrelerde askıya bir anti-fare (belirli izotip), Fc ikincil poliklonal antikor Birleşik AlexaFluor 647 için karanlık oda sıcaklığında 1 h için.
    1. 250 x g 5 min ve yıkama hücreler için de 3 x 0.5 mL buz gibi PBS santrifüj kapasitesi. 0.5 mL PBS hücrelerde askıya alma.
      Duraklat: Hücreleri buzdolabında saklanabilir.
      Not: İlgi mAb doğru izotip tanır ikincil bir antikor seçmek için esastır. AF647 propidium iyodür (PI) çekirdeği boyama ile müdahale değil, uzak kızılötesi emisyon nedeniyle seçilir.
  6. PI kapsayıcı hücreleri ile 10 μg/mL bir konsantrasyon ekleyin. Ardından, 1 x 105 hücreleri cam slayta montaj medya ve kapak cam coverslip ile kullanarak bağlayın.
  7. Bir Plan Apo 60 X yağı daldırma amaçta NA 1,42 ters bir lazer confocal mikroskobu tarama hücrelerle inceleyin. PI Floresans 488 nm argon lazer ve 600-650 nm için ayarla spektral tarama prizma kullanarak bulmak. AF647 floresan için 633 nm helyum-neon lazer ve 650-700 nm için ayarla spektral tarama prizma kullanın. Floresans emisyon PI ve AF647 sırayla toplamak.
    Not: değerlendirme ve karşılaştırma hücrelerin genelinde aynı ayarı kullanın. Ancak, Sigara trypsinized hücrelere kıyasla trypsinized hücreleri ayarlarını gerekir.
  8. Görüntüleri elde etmek için mikroskop bilgisayar yazılımı kullanın. 1024 x 1024 piksel ortalama 2 X çizgi ve seri yatay optik bölümleri ile tüm hücre kalınlığı 0,5 mikron aralıklarla alınan kullanarak görüntüleri toplamak. Görüntüleri gibi yığılmış z-projeksiyonlar dört ardışık dilimleri en fazla Floresans yoğunlukta mevcut.
  9. Hücreleri mikroskop bilgisayar yazılımı ile analiz. Kayıt conjugates hücresel dağıtım paterni. Özellikle, hücre içi Floresans sitoplazmada gruplandırılmış olup olmadığını ve hücre yüzey veya yaygın ve homojen yakınındaki değerlendirin. Ayrıca hücre başına göreli floresan yoğunluğu değerlendirmek.

3. AC inşaat ve 64 Cu hücre içi teslimat verimliliği değerlendirilmesi için hücresel ayırma radiolabeled

Dikkat: Yordamlar 3 ve 4 işleme ve düzenleme radyoaktivite içerir. Aşağıdaki adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar güvenlik eğitimi ve--dan onların ev kurumun radyasyon güvenliği otoritesi onaylı protokolleri onayladığınız.

Not: Yordamlar 3 ve 4'biz mAb A14, invaziv mesane kanseri antijen IL-5Rα41için belirli olan kullanın. Ayrıca, tüm deneylerin zaman 64Cu kısa yarılanma nedeniyle hassas vardır. Genel olarak, bu in vivo çalışmalar için en iyi vitro deneyler gerçekleştirmek için geçen 1 hafta beklemek ve 72 s daha uzun 's.

  1. Bir 1.7 mL tüp 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic asit (NOTA-NHS) 10 mM bir konsantrasyon içinde DMSO askıya alma.
  2. 0.1 M sodyum bikarbonat pH 8.6 oda sıcaklığında 1 h için bir birim ≤ 0,5 mL (son NOTA-NHS hacim % 2 Hacmen toplam hacminin geçmemelidir), NOTA-NHS A14 (2 mg malzeme başlayan) ile 50-Fold molar aşırı tepki.
  3. Arındırmak ve arabellek-Satım NOTA-A14 bir Ultrafiltrasyon cihaz PBS pH 7,6 (bkz. Adım 1.4) kullanarak.
  4. ChAcNLS sonraki ek adımları 1.2-1.6.
  5. NOTA-A14-ChAcNLS (250 μg toplu işlemleri) 64CuCl2 0.1 M sodyum bikarbonat, pH 5.5 37 ° C ≤ 1 h için içinde 100 megabecquerel (MBq) ile tepki 0.1 mL. 64 Cu CIMS 42TR-PET cyclotron üretilir.
  6. 64Cu-A14-ChAcNLS PBS pH 7.4 istenen konsantrasyonu bir Ultrafiltrasyon aygıtı kullanarak içinde konsantre (bkz. Adım 1.4).
  7. Kromatografi kullanarak 64Cu-A14-ChAcNLS anlık ince katmanlı Kromatografi (ITLC) tarafından şeritler ve 0.1 M, pH 5.5 sodyum sitrat (ITLC eluent) radiolabeling verimliliğini solvent belirleyin. 0.5 μL aliquot reaksiyon çözüm ITLC striptiz kulübüne uygulanır. Bir autoradiograph şeridinin gerçekleştirme ve sayısal görüntü alma.
    1. Bağlı oranı elde edilir ve 64Cu ücretsiz Dansitometresi gerçekleştirin. Ücretsiz 64Cu içerik > %5 ise, önceki adıma dönüp ve ek arıtma gerçekleştirin.
    2. Buna ek olarak, SDS-sayfa Coomassie toplamalardan değerlendirmek için boyama ile gerçekleştirin. Bir ikinci SDS-jel bir autoradiograph tarafından takip radiolabeled toplama türü olup olmadığını belirlemek için sayfa gerçekleştirin.
  8. Kalite kontrol nokta bağlama benzeşimi: konsantrasyonları artan, 64Cu-A14 conjugates kuluçkaya (0-100 nM) yinelenen mL başına 1 x 106 hedef hücreleri ile içinde. Nonspesifik bağlama tahmin etmek için hücreleri etiketlenmemiş A14 100-fold molar fazlalığı huzurunda 64Cu-A14 conjugates yinelenen örnekleri karıştırın.
    1. 1 h kuluçka buz sonra hücreleri yıkama ve toplam ilişkili antikor örnekleri ve gama sayacı örneklerinde toplam nonspesifik ilişkili antikor saymak. Assay olarak kullanılan reaktif ücretsiz 64Cu-A14 (nM) karşı özel bağlayıcı (Toplam ilişkili antikor - spesifik olmayan antikor bağlı) grafikle. Ayrışma sabiti (Kd) grafik yazılımı kullanarak doğrusal olmayan regresyon tarafından belirler.
  9. 64Cu hücresel birikimi Etütler: 100 hücrelerle tedavi 64Cu etiketli A14 nM 1 h, 6 h, conjugates ve 37 ° C'de 24 saat daha önce açıklandığı gibi33. Reseptör aracılı içselleştirilmesi engellemek için değiştirilmemiş A14 blok IL-5Rα sitelerine ve 4 ° C'de huzurunda tedavisi gibi ek parametreler içerir.
  10. Tanımlı zaman noktaları, daha önce açıklandığı adım olarak 2.3 - 2.3.2, PBS içeren % 0.25 tripsin 0.5 mL ekleyin ve ardından EDTA 37 ° C'de nötralizasyon ve çamaşır.
  11. Plazma zarı lizis arabellek % 1'i içeren hücrelerde kuluçkaya NP-40, 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 arabellek buz 10 dakika süreyle santrifüj kapasitesi 90 x g 5 min için de plazma zarı lysed hücreleri.
  12. Süpernatant çıkarın ve taze tüpü yerleştirin. Bu sitoplazmik kesir temsil eder. Çekirdek 3 yıkama buz gibi PBS x ve yıkama sitoplazmik kesir ekleyin.
  13. Nükleer ve sitoplazmik kesirler içeren şişeleri mühürlü emin olun. O zaman onlara karşı MBq için ham sayıları dönüştürmek için 64için Cu kalibre bir gama yerleştirin.
  14. Okan/c, kısıtlı bir nükleer protein ve Rab7 için Western blot analizi gerçekleştirerek çekirdeği yalıtım kalitesini belirlemek için bütün bir bol sitoplazmik protein hücre lysate, nükleer ve sitoplazmik kesirler.
    1. Radyo-immunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek ve plazma zarı lizis arabellekte 500 μL hücrelerle tedavi 5 x 106 adım 3.12 içeren % 1, % 2 ve % 4 NP-40. Ayrıca, izole çekirdeklerin RIPA arabellek izole nükleer protein elde etmek için 500 μL içinde tedavi.
    2. İzole nükleer, sitoplazmik ve tüm hücre proteinler 4 soğuk aseton örnek hacmi x-20 ° C'de 60 dk için kullanarak çökelti 13.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve protein Pelet çıkarmak değil dikkatli olmak süpernatant dikkatle boşaltmak. PBS proteinler çözülmeye 100 μL ekleyin.
    3. 10 μg protein % 10 SDS-sayfa jel her kuyunun içine yükleyin. Elektroforez 1.7-1.9 içinde açıklandığı gibi gerçekleştirin. Western Blot transfer refeference 43daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirin.
    4. En iyi işaretleri ~ 40 kDa MW için karşılık gelen merdiven tanımlamak. Membran bu işaretleyici, ikiye böldüm. Daha yüksek MW proteinler ile Lamin A/C özel antikorlar içeren leke sonda. Membran Rab 7 özel antikorlar ile alt MW proteinler ile sonda. Batı leke iyi bilinen bir teknik ve bu protokol için açıklanmayan.

4. evde beslenen hayvan görüntüleme değerlendirme tümör hedefleme

Not: heterotopik xenografts oluşturmak farelerde tümör hücreleri geliştirme teknikleri iyi bilinen ve çoğu laboratuvarlar kurum içi iletişim kuralları kendi tümör sistemi için özel olarak tasarlanmış. Böylece, bu protokol kapsamında değildir. Xenograft modeli IL-5Rα-pozitif invaziv mesane tümörleri HT-1376 ve HT-B9 taşıyan nonobese şeker hastası/ağır kombine immünyetmezligi (NOD/SCID) fareler olacak. IL-5Rα-pozitif invaziv mesane tümör hücreleri xenograft toplam hücrelerinin > %66 oluşturmaktadır. Buna ek olarak, sadece ~ %11 IL-5Rα-pozitif HT-B9 hücre gelişmiş xenografts41içinde yer alan. Böylece bu modeli öngörülebilir hasta tümör heterojenite temsil eden iki tümör içinde tümör AC hedefleme değerlendirmek için mükemmel bir örnek sağlar.

  1. ≥ içeren gruplar halinde 4 (NOD/SCID) fareler, enjekte 20-30 μg (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS ve 64Cu-A14 kuyruk damar içine.
  2. Aynı günde 64Cu (%ID/g) dokusunun gram başına enjekte doz radyoaktif sayıları saniyedeki dönüştürmek için 5 MBq içeren bir silindirik phantom (24.8 mL) yerleştirin.
  3. 48 saat bekleyin ve sonra bir indüksiyon odası ile 1, 5 L/dk oksijen akışı ile % 2 isoflurane yerleştirerek fareler anestezi. Steril oftalmik merhem fare gözlere indüksiyon sonra evde beslenen hayvan tarayıcı içine yerleştirme önce uygulanır.
  4. Hızla fareyi bir evde beslenen hayvan tarayıcı tabloya davranarak yüzükoyun bir burun konisi için isoflurane ile aktarın. Pozisyon solunum ve rektal sonda ve fizyolojik şartlarda deneme sırasında daha önce korunduğundan emin olmak için sıcaklık ve solunum hızı monitörü 44nitelendirdi.
  5. Bir düzenli örnekleme modu ayarı ve 250-650 keV bir enerji penceresini kullanarak evde beslenen hayvan veri toplama başlatın. Genellikle, bir 45 dakika statik tarama fare başına yeniden yapılanma ve yüksek kaliteli evde beslenen hayvan görüntü üretimi için yeterli çakışık olayları sağlamak için yeterli olur.
  6. 64Cu-AC inceden inceye gözden geçirmek sonra fare tarayıcıdan çıkarın ve kafese geri yerleştirin. Fareyi yeterince hayvan tesisine dönmeden önce kurtarmak izin verir.
  7. Yeniden oluşturulan görüntü 20 yinelemeden üç boyutlu maksimum olabilirlik Beklenti Maximization algoritması kullanarak elde.
  8. Bölge faiz (ROI) analiz tümör ve görsel olarak değerlendirilebilir organların AMİD yazılımını kullanarak gerçekleştirin.
    1. ROIs nicel %ID/g verileri el ile 3D serbest aracı ayarını kullanarak elde etmek için çizmek ve dikkatle tümör ya da bitişik uyluk kas betimlemek. ROI piksel başına sayıları %ID/g için önceki adımdaki 4.2 dönüştürülür.
  9. 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS görüntüleri tümör kontrast ve nicel yatırım Getirisi % kimliği/g ve tümör arka plan oranları için karşılaştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yordam 1 için 7 g 3 inşaatı bir crosslinker çok güvenilir olduğu gibi sulfo-SMCC kullanarak ChAcNLS ile değiştirilmiş. Genellikle, bir % 12 jel yüklenen ve SDS-PAGE tarafından analiz, MW sulfo-SMCC-- 7 g-3 oranları artırmak için orantılı olarak ayırt kademeli artar bu sonuçlarında kullanılan ve ChAcNLS için ayrı ayrı değerlendirilmesi ağır ve hafif zincirleri için izin verir fiil (şekil 3). 7G 3, 10, 20, 25- ve ardından Rf ölçü ve MW ekstrapolasyon sonuçlarında 3, 7, 10 ve 20 ChAcNLS molekülleri 7 g 3 başına 50-1 sulfo-SMCC-- 7 g-3 oranları tepki gösterdi. Dansitometresi tarafından > %90 7 g 3 3-10 ChAcNLS ile modifiye için yüzde monomer türdür. 7 G 3-ChAcNLS20 için Toplam % 45 türüdür. Bu etkili bir 7 G 3-ChAcNLS seçmek için eşlenik henüz daha da geliştirilmesi için SDS-sayfa basittir gösterir. Her ne kadar hafif antikor zincirlerle bulaşması antikor glikozilasyon oluşabilir, bu toplama türü tanımlaması ile karışmaz.

Yordam 2 için temsilcisi veri tripsin ve hiçbir tripsin hücre içi verimlilik biriktirme peptid-modified ACs virüs kaynaklı değerlendirirken kullanma arasındaki farklar gösterir. Bu örnekte, 7 G 3-ChAcNLS, hücre içi birikimi artırma olanağı ve tripsin (şekil 4) olmadan tedavi hücrelerdeki değerlendirilebilir. Ancak, karşılaştırma için AC verimliliği ve seçicilik belirlemek için kullanılan conjugates birikimi yorumlarken trypsinization önemi açıktır. Trypsinization gibi değiştirilmemiş 7 g 3 ile kurulacak temel hücre içi Floresans düzeyi sağlar. Bir 7 g 3 küçük resimde sitoplazma için sınırlıdır ayrıntı. Buna ek olarak, değil trypsinized hücreleri, 7G 3 özel Floresans hücre yüzeyine IL-3Rα overexpression hücre yüzeyinde nedeniyle sınırlıdır. Hücre yüzeyinde Floresans hakim ve böylece görüntülenir üzerinden hücre içi Floresans engellediği için hücre içi birikimi ve dağıtım araştırmak zorlaştırır. Hücreleri trypsinizing da özgüllük ile IgG-ChAcNLS delil olarak değerlendirirken önemlidir. Biz o orada bazı non-spesifik Floresans hücre yüzeyinden ama hücre içi birikimi hücreleri değil trypsinized peptid tarafından neden düzeyini belirlemek mümkün değildir görebilirsiniz. Son olarak, trypsinization bir yanlışlıkla yeni geliştirilen AC hedef hücrelerin içinde birikir değil yorumlamak olabilir. 7 G 3-NLS ile da görüldüğü gibi Floresans çoğunluğu olmayan hücreler trypsinized tekrar hücre yüzeyinden olduğunu. Trypsinization sonra bir 7 G 3-NLS birikir, hedef hücrelerin içinde sınırlı da olsa gözlemleyebilirsiniz.

Yordam 3 için temsilcisi veri kalite kontrol için inşaat, benzeşme ve vitro yükü teslim verimliliği ve özgüllük için Radyoizotop 64ile A14-ChAcNLS Cu gösterir. Bir % 12 polyacrylamide jel içeren 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, radyografik görüntüler üzerinde Dansitometresi gerçekleştirilen veya 64Cu-A14-ChAcNLS göstermek radiolabeled conjugates % 100 monomer türler (5A rakam) vardır. 64 Cu-A14-ChAcNLS IL-5Rα için nanomolar ilgi gösterir. A14-ChAcNLS 64Cu-A14-ChAcNLS konsantrasyonları artan bir fonksiyonu olarak özel bağlayıcı yaklaştı doygunluk 3-5 nm HT-1376 ve HT-B9 hücreleri (şekil 5B) konsantrasyonlarda saptandı. Kd 64Cu-A14-ChAcNLS HT-1376 ve HT-B9 hücreleri için 6,4 ± 1.7 nM ve 3.1 ± 0,8 nM, sırasıyla yapıldı. ChAcNLS konjugasyon A14 yaklaşık 2.5-fold benzeşme IL-5Rα HT-1376 ve HT-B9 hücreleri için azaltılmış. Radyoaktivite çekirdeği ve sitoplazmada artış 64tarafından Cu-A14-ChAcNLS teslim ortaya sayma gama özeldir ve zaman içinde (şekil 6) artırır. Gama sayma gösterir genellikle yaklaşık > 64Cu-A14-ChAcNLS 64Cu-A14-ChAcNLS aşırı huzurunda tedaviyle karşılaştırıldığında ile tedavi 6-fold nükleer ve hücre içi birikimi hücrelerinde artış değiştirilmemiş A14 veya ne zaman tedavi çalışmaları 4 ° C'de (şekil 6A) gerçekleştirilir. Orada da bir ≥ 3-fold içinde nükleer artırmak ve 64Cu 64Cu-A14 ve 64Cu IgG ChAcNLS tüm zaman noktalarda ile tedavi hücrelere göreli hücre içi birikimi (şekil 6B) test.

Şekil 7 hücre Ayırma Protokolü önemini göstermektedir. HT-1376 ve HT-B9 hücreleri % 1, % 2 veya % 4 içeren plazma zarı lizis arabellek ile inkübe NP-40. İzole çekirdek sadece içermesi gerektiğini Lamin A/C. buna göre sitoplazmik kesirler Rab7 için özel olmalıdır. Bir denetim olarak, tüm hücreler RIPA arabellek ile lysed her iki kesirler Okan/c için pozitif olmalıdır. Bu iletişim kuralı lysed HT-1376 hücreleri nükleer kısmını değerlendirirken, orada hiçbir Rab7 mevcut gösterir. Buna ek olarak, hiçbir Okan a/c sitoplazmik kesir mevcut vardır. Ancak, azaltılmış miktarda Rab7 %4 ile lysed hücrelerden alınan sitoplazmada yoktur NP-40 (şekil 7A). Bu büyük olasılıkla bu %4 NP-40 lizis arabellek ek olarak plazma zarı nükleer membran bozuyor göstermektedir. Bu nükleer proteinler sitoplazmik protein ile karıştırma neden olur ve böylece Rab 7 konsantrasyonu sulandırır. Bu Rab 7 mevcut azaltılmış miktarda açıklar. HT-B9 hücreleri daha HT-1376 hücre daha duyarlıdır. Plazma zarı lizis arabellek ile tedavi ederken %4 içeren NP-40, Okan A/C açıkça görülür sitoplazmik kesir (şekil 7B). Nükleer kesir a/c Okan miktarında azalma karşılık gelen vardır. Rab7 miktarı sitoplazmik kesir gözle görülür göre % 1 azalır gibi HT-B9 hücreleri de %2 NP-40 lizis arabellek hassas NP-40. Böylece, bir çekirdek ve hücre içi alanı yük birikimi nicel sonuçları doğru olması ilgi belirli hücreleri ile hücresel ayırma \t\ten. Bu bir roman AC nükleer yerelleştirme verimliliğini değerlendirmek için önemlidir.

Yordam 4 için evde beslenen hayvan düşsel vasıl 48 saat sonrası enjeksiyon 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS veya 64Cu-A14-ChAcNLS HT-1376 ve HT-B9 heterotopik xenografts ters arka ayakları üzerinde taşıyan farelerde tümör görselleştirme için sağlar. Özellikler (şekil 8) hedefleme. Bizim örnekte olduğu gibi evde beslenen hayvan görüntülerin görsel denetim HT-1376 ve HT-B9 tümör hedefleme yetenekleri 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14 ve 64Cu-A14-NLS (şekil 8A) ortaya koymaktadır. Ancak, görsel muayene ile HT-B9 tümörler olarak zor olduğu durumlar, yatırım Getirisi analizi tümör kas oranları (şekil 8B) belirlemek için kullanılabilir.

Figure 1
Şekil 1: ChAcNLS-modified mAbs. NLS artıkları SV-40 büyük T-antijen (KKKRKV) üzerinden bir N-terminal sistein tarafından şapkalı spacer artıkları arasında gözükeceksin. Kolik asit (yeşil sol parantez) sistein için yukarıda açıklanan 34birleştirilmiştir. İnşaat ve arıtma ChAcNLS sonra sistein sulfhydryl grubu konjugasyon yolu ile sulfo-SMCC için kullanılır (kırmızı köşeli ayraç; zaten mAb için ekli gösterilen). Not: mAb (150 kDa) ve ChAcNLS (1.8 kDa) are değil ölçmektir. Uyarlanmış ve Paquette izni ile yayımlanmaktadır, M. ve ark. NLS-kolik asit konjugasyon IL-5Rαspecific antikor için hücresel birikimi ve mesane kanseri modelinde içinde vivo tümör hedefleme özellikleri geliştirir. Bioconjugate Kimya. doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
-

Figure 2
Resim 2: sonraki işlem Confocal mikroskobu göre analiz ve hücre ayırma kalite analizi ve AC hücre tedavi yaklaşımı şematik. Kırmızı oklar temel adım 2.2, 2.3, 3.15 ve 3.15.4 karşılık gelir. Çekirdeği ve gelişmiş toplam hücre içi birikimi için adapte ve yazdırılan ile izin Beaudoin, S. vd. ChAcNLS, bir roman değişiklik antikor Conjugates izin hedef hücre özgü Endosomal kaçmak için yerelleştirme. Moleküler İlaç sanayii. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).

Figure 3
Şekil 3: mAbs ChAcNLS-modified analizini. Azalan bakiyeli SDS-sayfa çalışan merdiven (L) ile ilgili moleküler ağırlık kilodalton (kDa) ve değiştirilmemiş 7 g 3 ağır ve hafif zincirleri referansları olarak gösterilen. Aşağıdaki şerit geçiş bantları 7 g 3 3, 7, 10 ve 20 ChAcNLS ile modifiye ağır ve hafif zincirleri vardır.

Figure 4
Şekil 4: mAb hücre içi dağıtım analizi ve birikimi. Hücre içi 7 g 3 gösteren confocal mikroskobu görüntüleri dağıtım ve IL 3Rα pozitif lösemi hücreleri 7 g 3 ile tedavi göreli Floresans birikimi 7 G 3-ChAcNLS, IgG ve IgG-ChAcNLS. Hücreleri trypsinized veya fiksasyon önce trypsinized değil. Çekirdeği propidium iyodür (PI; kırmızı), murine-Fc-AF647 boya (mAb; yeşil) lekeli ve PI/mAb birleştirilir. 50 mikron ölçektir. Tripsin ve tripsin grup içinde görüntüleri arasında gösterilen farklı ACs aynı araç ayarları ile elde. Şekil 4 tripsin bölümünü refefence 34 izinle adapte. Uyarlanmış ve Beaudoin izni ile yayımlanmaktadır, S. vd. ChAcNLS, antikor-izin Conjugates bir roman değişiklik hücre özgü Endosomal kaçış, yerelleştirme çekirdeği ve gelişmiş toplam hücre içi birikimi için hedef. Moleküler İlaç sanayii. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).

Figure 5
Şekil 5: 64Cu-A14-ChAcNLS saflık ve benzeşimi. (A) 64A14 Cu etiketli, A14-NLS, radiochemical saflığı A14-ChAcNLS tarafından SDS-sayfası autoradiography tarafından takip kontrol ettim. (B) özel bağlayıcı Eğriler için 64Cu-A14 ve 64Cu-A14-ChAcNLS HT-1376 ve HT-B9 hücreleri üzerinde. Hata çubukları REPLICATE içinde gerçekleştirilen deneme standart sapması gösterir. Uyarlanmış ve Paquette, izni ile yayımlanmaktadır M. ve ark. NLS-kolik asit konjugasyon IL 5Rα özel antikor için hücresel birikimi ve mesane kanseri modelinde içinde vivo tümör hedefleme özellikleri geliştirir. Bioconjugate Kimya. doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).

Figure 6
Şekil 6: 64Cu nükleer ve hücre içi birikimi. Hücre tedavisi temsilcisi örnek nüsha gerçekleştirilen (hata çubuklarını göstermek standart sapma)(a)özgüllük ve (B) birikimi enhancement-in 64Cu-A14-ChAcNLS göstermek için. % Birikimi çekirdeği (sol kapı aynası) ve toplam hücre içi alanı (doğru panelleri) göre IL-5Rα-pozitif invaziv mesane kanseri hücreleri tedavi sırasında kullanılan radyoaktivite toplam tutarı gösterilir. Hata çubukları REPLICATE içinde gerçekleştirilen deneme standart sapması gösterir. * p ≤0.05 gösterir.

Figure 7
Şekil 7: hücre ayırma yordamı analizini. (A)nükleer ve (B) Cytoplasmic kesirler Batı leke/c Okan (üst lekesi; Kırmızı oklar) ve Rab HT-1376 ve plazma zarı lizis arabellek % 1, % 2 veya 4 içeren hücrelerde HT-B9 tedavi elde edilen 7 (alt lekesi; siyah oklar) için % NP-40. Tüm hücreleri ile RIPA tampon lysed kullanılan pozitif kontrol olarak Okan/c ve Rab7 için her iki kesirler. Çalışan standartları (L) yalnızca üst lekesi tasvir edilmektedir. Üç ok Okan/c için birden çok onun izoformlarının nedeniyle gösterilir. Adapte ve yazdırılan ile izninden Paquette, M. vd. NLS-kolik asit konjugasyon IL 5Rα özel antikor için hücresel birikimi ve mesane kanseri modelinde içinde vivo tümör hedefleme özellikleri geliştirir. Bioconjugate Kimya. doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).

Figure 8
Şekil 8: evde beslenen hayvan görüntüleme ve yatırım Getirisi analizi tarafından tümör hedefleme Vivo içinde analiz. 48 saat sonrası enjeksiyon NOD/SCID farelerin taşıyan HT-1376 (Kırmızı oklar) ve intravenöz enjekte 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS ve 64Cu-A14-ChAcNLS ile HT-B9 (mavi oklar) tümörleri(a)evde beslenen hayvan görüntüleri. Yeşil ok karaciğer alımını olduğunu. Kas ROI çizim kırmızı daire ile gösterilir. ACs 48 saat sonrası enjeksiyon, (B) YG HT-1376 ve HT-B9 tümör kas oranları. Hata Çubuklarõn deney standart sapması 10 ROIs fare başına n = (n = 5). * p 0.05 belirtir.

Tat
CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20
CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30
CGISYGRKKRRQRRR 29
GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25
TRQARRNRRRRWRERQRGC 26
NLS
CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27
Kolik asit-CGYGPKKKRKVGG 34

Tablo 1: Tat ve SV-40 büyük T antijen türetilmiş peptidler olarak AC değişiklikleri kullanılan listesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anti-kanser ajanı sistemik teslimini büyük hedefleri birikimi tümör site ve kanser hücrelerinin içinde alımını artırmak ve sağlıklı dokularda istenmeyen yan etkileri azaltmak için vardır. Tümör hücreleri moleküler yüklerini hedef AC teslim tedavi ve tümör tespit için çok umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, etkinlik eksikliği endosome tuzak tarafından neden olduğu ve önemli bir meydan okuma, akış lizozomal bozulması kalır. Yeni nesil ACs inşası için bir örnek ChAcNLS peptid bu protokolü kullanır, açıklanan yordamları uyarlanabilir hücre içi teslim edilen yük miktarını artırmak amacı ile geliştirilen herhangi bir peptit-modified AC iken kanser hücrelerini hedefleyen.

Bu iletişim kuralı en kritik adımlar şunlardır: 1) belirlenmesi ve yüksek MW sınırlama toplamak türler; 2) trypsinization hücre hücre içi birikimi belirlemek için analiz önce; 3) kalite güvencesi hücresel ayırma işlemleri gerçekleştirme; ve 4) evde beslenen hayvan içinde vivohedefleme tümör değerlendirmek için Imaging gerçekleştirme.

MAbs için virüs kaynaklı peptidler konjugasyon olasılıkla mAbs arasında intramolecular crosslinking neden olur yüksek MW toplam türler içinde yol açmaz önemlidir. Bu ilk endişe ve daha fazla ilerlemeden önce ele alınmalıdır. İstenmeyen toplamları içeren peptid-modified ACs ile ilerlemeye yönleri hücre içi ve in vivo yükü teslim profili gibi sahte kanıtlar sağlamak sonuçlar verebilir. MAbs üzerinde reaktif maleimides ne büyük olasılıkla kovalent toplama için sorumlu olmasıdır. Sulfo-SMCC-mAb oranını azaltmak için bir çözüm olabilir. N-asetil türevleri amino asitlerin Cys, Lys, gibi kullanmak için başka bir alternatif olduğunu onun, Ser ve peptid konjugasyon mAb maleimide aktif 45sırasında üç kere. Nükleofilik yan zincir SMCC maleimide yan ile tepki ve içi-antikor crosslinking azaltmak edebiliyoruz. Alternatif olarak, boyut dışlama Kromatografi tarafından ayrılıktan sonra konjugasyon monomer türler 45yalıtmak için kullanılabilir. Peptid antikor için siteye özgü konjugasyon da gerçekleştirilebilir. Örneğin, antikor karbonhidratlar hangi monomer türler 24verimli bir şekilde üretmeye göstermiştir peptidler için fiil için değiştirilebilir.

SDS-sayfa %12 polyacrylamide jeller ile AC türlerin büyük boy farklılıkları geniş bir bakış açısı elde etmek için ucuz ve etkili bir yöntemdir. % Polyacrylamide bir artış kullandıysanız, ağır zincir ve intramolecular türlerin ayrılması ayırt etmek zor olacak. İndirimli % polyacrylamide kullandıysanız, diğer taraftan, hafif zincirleri jel çalıştırmak muhtemeldir. 4-%20 polyacrylamide da içeren degrade jelleri iyi saklama için ağır ve hafif zincirleri üzerinde tek bir jel vardiya sağlar. Çeşitli analitik teknikler arasında biyomoleküler çözümlemesi için kullanılabilir, yüksek performanslı sıvı Kromatografi ve kapiller Elektroforez-SDS SDS-sayfasına ayrılık ve ACs 46karakterizasyonu için üstündür. Yine de, SDS-sayfa roman Bu ajanların ilk inşaat çözümlemek ve eylem aşağıdaki ders üzerinde karar vermek için erken ve ucuz bir yöntem olduğunu.

En fazla birkaç hücre yüzey proteinleri ve ilişkili ACs kaldıran kuluçka % 0.25 tripsin (Adım 2.3), içeren çözüm hücrelerinin önemli çünkü geliştirilmiş görselleştirme ve göreli hücre içi birikimi arasında artış sağlar antikorlar başvuru. Kamera parametrelerini maksimum floresan yoğunluğu, çekim için ayarlanır. Bu nedenle hücre hücre birikmiş AC miktarında çeşididir. Böylece, esir alma imge maksimum yoğunluk, hücrelerin daha az AC birikmesi ile de değerlendirilmek üzere sağlar. Ancak, kanser antijen genellikle son derece tümör hücreleri üzerinde gösterilir. Hücreleri sindirim için tripsin tarafından maruz değil, hücre yüzeyde ACs yayılan floresan görüntü hakim. Buna ek olarak, trypsinization geliştirme ACs ile ince ama önemli hücre içi birikimi özellikleri ile sınırlı olabilir.

Yüksek kaliteli hücresel ayırma sağlanması doğru 64Cu sitoplazma karşı çekirdeği içinde birikimi değerlendirmek önemlidir. ChAcNLS AC ve yükü hücre içi birikimi artırma olanağı çekirdeği 34etkin yerelleştirme kaynaklanmaktadır. Gelecekte virüs-peptidler geliştirilen gibi Bu peptidler da hücre içi yükü verimliliği artırmak için onların mekanizmasının bir parçası olarak çekirdek yerelleştirmek. Böylece, bu hücresel ayırma bu işlemi doğru bir şekilde detaylara yüksek kalitede olması önemlidir. Bu iletişim kuralı çekirdeği sitoplazmik işaretçileri için ve ayrıca nükleer işaretleri sitoplazmik kesir değerlendirilmesi önemini vurgular. Örneğin, Hu ve ark., geliştirilen AC Tat peptid ile değiştirilmiş ve Radyoizotop yükü 24nükleer birikimi araştırdı. Western blot analizi için calpain, bir bol sitoplazmik protein, nükleer kesir mevcuttu. Ticari nükleer izolasyon kitleri kullanıldığından bu büyük olasılıkla. Bu iletişim kuralı HT-1376 ve HT-B9 hücrelere farklı konsantrasyonları gerekli: NP-40 sağlam membranlar ile zenginleştirilmiş çekirdeği yalıtmak için gösterdi. HT-B9 hücreleri ile tampon lysed ne zaman % 4 içeren NP-40, Okan/c sitoplazmik kesir tedavi nükleer Membran bozulduğu ve Okan sitoplazma girmek a/c için izin gösteren içinde mevcut. Nükleer ve sitoplazmik kesirler dikkatli bir şekilde izole değilseniz, nükleer localization-e doğru toplam hücre içi birikimi katkısını belirlemek güç olabilir. Özellikle hedef hücre içi diğer bölmeleri endoplazmik retikulum, Golgi aygıtı ve mitokondri 47,48,49gibi biyolojik ve yapay-kaynaklı peptidler rapor ediliyor. Böylece, hücre içi bölmeleri yalıtım giderek ilgili olmaya başladı.

Bu iletişim kuralı 64Cu-A14-ChAcNLS HT-1376 ve HT-B9 tümörleri ile hedef açıklaması ile tamamlanır. Şekil 8evde beslenen hayvan Albümdeki görsel denetim, artan tarafından belirgin tümör evde beslenen hayvan sinyal bitişik göre azaltılmış arka plan 64Cu-A14-ChAcNLS çevreleyen sahip üstün HT-1376 ve HT-B9 Tümörleri (şekil 8A hedefleme ). Yatırım Getirisi analizi de tümör hedefleme değerlendirmek yeteneğini gösterir. Örneğimizde, tümör hedefleme ölçmek ve 64Cu-A14-ChAcNLS üstün AC (8B rakam) olduğunu göstermek için yatırım Getirisi tümör kas oranları kullanın. Evde beslenen hayvan görüntüleme AC sağlıklı organlara iyon değerlendirilmesi için de sağlar. Karaciğer antikorlar metabolize birincil organdır. Şekil 8A karaciğer anlamazdın 64Cu-A14-ChAcNLS ve 64Cu-A14 ile enjekte farelerde karşılaştırılabilir olduğunu gösterir. Bu erken geliştirme aşamasında bu veri ChAcNLS istenmeyen iyon neden olmaz öneriyor. 64 Cu yarı-canlıdır günlerce ACs için ideal olan değil 12,7 h, bir yarı ömrü vardır. Daha önce açıklandığı gibi görsel iletişim kuralındaki Zeglis ve Lewis tarafından uzun ömürlü Radyoizotop zirkonyum-89 (89Zr) fiziksel olan half-life mAbs için idealdir ve evde beslenen hayvan 50tarafından yansıma bir yük kullanmaktır. Böylece, birkaç gün içinde tümör teslim değerlendirmek için 89Zr tercih edilen bir seçenek vardır. Terapi nerede yüksek tümör alımını olumlu ve ile antikor 7zamanla artar bir hedeftir, bu özellikle önemlidir. Biodistribution de daha fazla hedefleme keşfetmek için bireysel organ alımı belirlemek için gerçekleştirilmesi gereken veya özelliklerini yeni iyon ACs geliştirdi. Ayrıca, fare ile değiştirilmemiş spesifik antikor blok reseptör sitelerde hedefleme özgüllük değerlendirmek için tümör hücreleri predosed. Yine de, 64Cu evde beslenen hayvan görüntüleme ve yatırım Getirisi analizi ile yeterince sağlamak ilk değerlendirmesi tümör, bu protokol için sunulan gelişmiş ACs teslim özellikleri.

Şimdiye kadar virüs kaynaklı peptidler ile modifiye ACs radioisotopes teslimat için sınırlı olmuştur. Bu kısmen tarihsel nedenlerden dolayı olduğunu ve aynı zamanda çünkü radioisotopes içinde in vitro ve in vivo sınama sırasında kolayca sayılabilir ve noninvaziv tüm vücut görüntüleme yöntemleri kullanarak görüntülenir. Doğal olarak, bu alan taşıma ve teslimat in payloads dışında radioisotopes, chemotherapeutics, enzimler ve oligonucleotides, gibi genişledikçe değişiklikler bu protokol için açıklanan teknikler geliştirilecek gerekecek. Örneğin, alternatif payloads hücre içi birikimi değerlendirmek için yeni yöntemler geliştirilmesi gerekir. Buna ek olarak, değişiklikler vivo içinde değerlendirme için arı gibi bu yükleri kolayca yansıması değil ve bu nedenle biodistribution, özgüllük ve tümör alımını verimliliği değerlendirmek zor olacaktır gerekli olacaktır. Bu nedenlerden dolayı radyonüklid payloads alternatif yükler ile gelecekteki gelişimi için vekil yükler olarak kalmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

Bu eser Kanser Araştırma Derneği (Kanada) ve CIMS tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr Samia AIT-Mohand ve Jean-François Beaudoin yardım için teşekkür ederiz. Dr. melek Lopez (Üniversitesi Güney Avustralya) mAb A14 için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sulfo-SMCC Thermo Scientific 22122 There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters EMD Millipore UFC505096 There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards BioRad 1610375EDU Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Scientific A-21235 1 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHS CheMatech C100
Lamin A/C antibody (N-18) Santa Cruz Biotechnology sc-6215
Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376362
A14 mAb BD Biosciences 555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Scientific NP0007
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-25ML
TF-1a cells ATCC ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium ATCC ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer Thermo Scientific 89900
AMIDE medical imaging software available at amide.sourceforge.net Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope Olympus
Fluoview Software Olympus www.olympus-lifescience.com
ITLC strips Biodex 150-771

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
  2. Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
  3. Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
  4. Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
  5. Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
  6. Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
  7. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  8. Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
  9. Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
  10. Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
  11. Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
  12. Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
  13. Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
  14. Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
  15. Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
  16. Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
  17. Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
  18. Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
  19. Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
  20. Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
  21. Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
  22. Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
  23. Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
  24. Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
  25. Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
  26. Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
  27. Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
  28. Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
  29. Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
  30. Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
  31. Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
  32. Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
  33. Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
  34. Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
  35. Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
  36. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
  37. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
  38. Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
  39. Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
  40. King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
  41. Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
  42. Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
  43. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  44. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
  45. Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
  46. Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
  47. Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
  48. Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
  49. Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
  50. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).

Tags

Biyomühendislik sayı: 133 Viral kaynaklı peptidler antikor-conjugates SDS-sayfa Confocal mikroskobu hücresel ayırma bakır-64 evde beslenen hayvan görüntüleme
Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaudoin, S., Paquette, M.,… More

Beaudoin, S., Paquette, M., Fafard-Couture, L., Tremblay, M. A., Lecomte, R., Guérin, B., Leyton, J. V. Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting. J. Vis. Exp. (133), e55440, doi:10.3791/55440 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter