פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול סיב שריר מהיר מנתח, המאפשר איכות מכתים משופרת, ובכך רכישה אוטומטית וכימות של אוכלוסיות סיבים באמצעות ImageJ התוכנה הזמין באופן חופשי.
Abstract
כימות של אוכלוסיות סיב השריר מספקת תובנה עמוק יותר את ההשפעות של מחלה, טראומה, והשפעות שונות אחרות על רכב שרירי שלד. זמן רב בשיטות שונות באופן מסורתי שימשו ללמוד אוכלוסיות סיבים בתחומים רבים של מחקר. עם זאת, לאחרונה פיתח שיטות אימונוהיסטוכימיים מבוסס על ביטוי החלבון שרשרת כבדה שרירן לספק אלטרנטיבה מהירה לזהות סוגי סיבים מרובים באזור אחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מהיר, אמין לשחזור עבור איכות מכתים משופרת, המאפשר רכישה אוטומטית של חתכים שלמים כימותים אוטומטיים של אוכלוסיות סיבים עם ImageJ. לשם כך, שרירי השלד מוטבעים נחתכים חתכים, מוכתמים באמצעות נוגדנים שרשראות כבדות שרירן עם נוגדנים ניאון משני DAPI מכתים גרעיני תאים. חתכים שלמים ואז נסרקים באופן אוטומטי באמצעות סורק שקופיות להשיג מרוכבים ברזולוציה גבוההתמונות של הדגימה כולו. ניתוחי אוכלוסיית סיבים מכן מבוצעים לכמת סיבים איטיים, ביניים ומהיר באמצעות מאקרו אוטומטי עבור ImageJ. הראינו בעבר כי שיטה זו יכולה לזהות אוכלוסיות סיבים מהימנות במידה של ± 4%. בנוסף, שיטה זו מקטינה השתנות למשתמש שאר וזמן לכל ניתוחי משמעותי באמצעות ImageJ פלטפורמת הקוד הפתוח.
Introduction
רכב שריר שלד עובר שינויים עמוקים במהלך תהליכים פיסיולוגיים כגון 1 הזדקנות, 2, תרגיל 3, 4, 5, 6, 7, או תהליכים פתופיזיולוגיים כגון מחלה 8, 9, 10 או טראומה 11. לפיכך, מספר תחומים להתרכז מחקר על ההשפעות המבניות של תהליכים אלה על מנת להבין שינויים פונקציונליים. אחד ההיבטים המרכזיים בקביעת תפקוד שריר הוא בהרכב של סיבי שריר. סיבי שריר להביע שרשרת כבדה שונה שרירן (MHC) חלבונים מסווגים ובכך לתוך סיבי איטי, בינוני, או מהר 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. יש פיסיולוגי, שרירים קומפוזיציות סיב שריר שונים בהתאם לפונקציה שלהם בגוף. באמצעות הקלדה סיב השריר, אוכלוסיות סיבים ניתן לכמת לזהות לאימוצו לתהליכים פיזיולוגיים או pathophysiological 7, 17. מבחינה היסטורית, מספר שיטות רב הזמן יושמו להבדיל בין סוגי סיבי השריר. לשם כך, סיבי שריר סווגו בין אם על ידי תגובתיות של ATPase שרירן ברמות pH שונות או פעילות אנזים שריר. כפי איכויות סיבים שונים לא ניתן היה להעריך באזור אחד, חתכים מרובים נדרשו לזהות את כל סיבי השריר ולאפשר כימות ידנית 14, 16, 17,= "Xref"> 18, 19, 20, 21, 22. לעומת זאת, הפרסומים האחרונים השתמשו אימונוהיסטוכימיה (IHC) כנגד חלבון שרשרת כבדה שרירן להכתים סוגי סיבים מרובים במהירות בתוך חתכים יחיד. בהתבסס על היתרונות של הליך זה, זה נחשב כעת את תקן זהב ניתוח אוכלוסיית סיב שריר 19, 23, 24. באמצעות פרוטוקולים מכתימים IHC השתפרו, הצלחנו לאחרונה מראה כי הרכישה אוטומטית לחלוטין של חתכי שריר שלמים וכימותי סיב שריר אוטומטית עוקבים אינה ריאלית באמצעות ImageJ פלטפורמת הקוד הפתוח. בהשוואת כימות ידנית, ההליך שלנו ספק ירידה משמעותית זמן (כ 10% מכלל ידני מנתח) נדרש לכל שקופית בעת היותו מדויק עד ± 4% 25 </sעד>.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לתאר מדריך מהיר, אמין, עצמאי-למשתמש כימותי סיב שריר אוטומטיים בשרירי עכברוש כולו באמצעות פלטפורמת קוד פתוחה. בנוסף, אנו מתארים שינויים פוטנציאליים אשר יתירו את השימוש בו עבור דגימות אחרות כגון עכברים או שרירים אנושיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, אנחנו מדגימים מתודולוגיה נגיש נרחב ללמוד ובאופן אוטומטי לכמת את האוכלוסיות סיבי שריר של חתכי עכברוש באמצעות אימונוהיסטוכימיה באופן יעיל בזמן. עבור שחזור, אנו מציגים צעד מפורט על ידי תיאור צעד ושינויים פוטנציאל יישומי מינים אחרים לא המתוארים במחקר זה. יתר על …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר כריסטיאן דופלר. ברצוננו להודות סבין ראושר מן הדמיה מתקן Core באוניברסיטה הרפואית של וינה, אוסטריה על התמיכה לאורך כל הפרויקט. נוגדנים ראשיים פותחו על ידי Schiaffino, ס, מבנק התפתחותית מחקרים Hybridoma, נוצר על ידי NICHD של NIH ומתוחזק באוניברסיטה של איווה, מהמחלקה לביולוגיה, איווה סיטי, IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
Referências
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
