Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica
Summary
Aquí, se presenta un protocolo para análisis rápido de la fibra muscular, lo que permite mejorar la calidad de la tinción, y la adquisición de ese modo automático y la cuantificación de las poblaciones de fibra utilizando el ImageJ software disponible libremente.
Abstract
La cuantificación de las poblaciones de fibras musculares proporciona una visión más profunda de los efectos de la enfermedad, trauma, y varias otras influencias sobre la composición de músculo esquelético. Varios métodos que requieren mucho tiempo se han utilizado tradicionalmente para estudiar las poblaciones de fibra en muchos campos de la investigación. Sin embargo, recientemente desarrollado métodos inmunohistoquímicos sobre la base de la miosina expresión de la proteína de cadena pesada de proporcionar una alternativa rápida para identificar múltiples tipos de fibra en una sola sección. A continuación, se presenta un protocolo rápido, fiable y reproducible para mejorar la calidad de la tinción, lo que permite la adquisición automática de las secciones transversales integrales y cuantificación automática de las poblaciones de fibra con ImageJ. Para este propósito, los músculos esqueléticos incrustadas se cortan en secciones transversales, teñidas utilizando miosina anticuerpos cadenas pesadas con anticuerpos fluorescentes secundarias y DAPI para la tinción de núcleos de células. secciones transversales enteras se escaneados automáticamente usando un escáner de diapositivas para obtener de alta resolución compuestoimágenes de la muestra completa. análisis de población de fibra se llevan a cabo posteriormente para cuantificar fibras lentas, intermedias y rápidas utilizando una macro automatizado para ImageJ. Hemos demostrado anteriormente que este método puede identificar poblaciones de fibra de forma fiable a un grado de ± 4%. Además, este método reduce la variabilidad inter-usuario y la hora por los análisis significativamente utilizando la plataforma ImageJ de código abierto.
Introduction
Composición del músculo esquelético sufre cambios profundos durante los procesos fisiológicos tales como el envejecimiento 1, 2, ejercicio 3, 4, 5, 6, 7, o procesos fisiopatológicos tales como la enfermedad 8, 9, 10 o trauma 11. Por lo tanto, varios campos de investigación se concentran en los efectos estructurales de estos procesos para entender los cambios funcionales. Uno de los aspectos clave que determinan la función muscular es la composición de las fibras musculares. Las fibras musculares expresan la cadena pesada de proteínas diferentes de miosina (MHC) y de ese modo se clasifican en fibras lentas, intermedio o rápido 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Fisiológicamente, los músculos tienen diferentes composiciones de fibra muscular dependiendo de su función en el cuerpo. Usando la tipificación de la fibra muscular, las poblaciones de fibra se pueden cuantificar para identificar adaptación a procesos fisiológicos o fisiopatológicos 7, 17. Históricamente, una serie de métodos que requieren mucho tiempo se han aplicado a diferenciar entre tipos de fibras musculares. Para este propósito, las fibras musculares se clasifican ya sea por la reactividad de la ATPasa de la miosina a diversos niveles de pH o actividad de la enzima muscular. Como diferentes calidades de fibra no pudieron evaluarse en una sola sección, se requieren múltiples secciones transversales para identificar todas las fibras musculares y permitir la cuantificación 14, 16, 17 manual,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. En contraste, las publicaciones recientes utilizan inmunohistoquímica (IHC) contra la proteína de la cadena pesada de la miosina para teñir rápidamente múltiples tipos de fibras en un solo secciones transversales. Sobre la base de las ventajas de este procedimiento, ahora se considera el estándar de oro en el análisis de población de las fibras musculares 19, 23, 24. El uso de protocolos de tinción IHC mejoradas, estábamos recientemente capaces de demostrar que la adquisición completamente automática de las secciones transversales de músculo entero y la posterior cuantificación de la fibra muscular automática es factible el uso de la plataforma ImageJ de código abierto. En comparación con la cuantificación manual, nuestro procedimiento proporcionado una disminución significativa en el tiempo (aproximadamente 10% de manual de análisis) requerida por diapositiva mientras que ser una precisión de ± 4% 25 </sarriba>.
El objetivo general de este método es el de describir una guía rápida, fiable, independiente del usuario a la cuantificación de la fibra muscular automática en músculos de rata enteros usando una plataforma de código abierto. Además, se describen las posibles modificaciones que permitan su uso para otros especímenes tales como ratones o los músculos humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos una metodología ampliamente accesible para estudiar y cuantificar las poblaciones de fibras musculares de las secciones transversales de rata mediante inmunohistoquímica de una manera eficiente el tiempo de forma automática. Para la reproducibilidad, se presenta un detallado paso a paso la descripción y modificaciones potenciales para las aplicaciones en otras especies no descritas en este estudio. Además, se discuten las ventajas del procedimiento, los requisitos previos para un funcionami…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación de Investigación Christian Doppler. Nos gustaría dar las gracias a Sabine Rauscher de la Imaging Core Facility de la Universidad de Medicina de Viena, Austria, por el apoyo durante todo el proyecto. Los anticuerpos primarios fueron desarrollados por Schiaffino, S., obtenido a partir del hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, creado por el NICHD del NIH y se mantuvo a la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
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