Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

उपयोग pHluorin टैग रिसेप्टर्स subcellular स्थानीयकरण और अवैध व्यापार पर नजर रखने के लिए

Published: March 16, 2017 doi: 10.3791/55466
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry, University of Kentucky, 2Department of Biomedical Sciences, Marshall University

Summary

एक पीएच संवेदनशील fluorophore के साथ एक झिल्ली प्रोटीन के बाह्य डोमेन लेबलिंग, superecliptic pHluorin (सितम्बर), की अनुमति देता है subcellular स्थानीयकरण, अभिव्यक्ति, और तस्करी निर्धारित किया जाना है। कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) के साथ इमेजिंग सितम्बर लेबल प्रोटीन परिधीय ईआर और प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन का स्तर की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है।

Abstract

समझौता झिल्ली प्रोटीन की तस्करी, विधानसभा, और अभिव्यक्ति एक दृष्टिकोण है कि और intracellular अंगों में रहने वाले उन लोगों प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीय लोगों के बीच differentiates की आवश्यकता है। पारंपरिक प्रतिदीप्ति आधारित माप की क्षमता अलग-अलग अंगों में रहने वाले झिल्ली प्रोटीन भेद करने की कमी है। अत्याधुनिक तरीके में कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) के साथ पीएच के प्रति संवेदनशील fluorophores युग्मन द्वारा पारंपरिक तरीकों के पार। TIRF रोशनी गिलास नमूना इंटरफ़ेस से लगभग 150 समुद्री मील दूर करने के लिए नमूना उत्तेजित है, इस प्रकार, पृष्ठभूमि को कम करने के लिए शोर अनुपात संकेत बढ़ रही है, और संकल्प को बढ़ाना। TIRFM में उत्तेजना मात्रा ऐसे परिधीय ईआर के रूप में प्लाज्मा झिल्ली और आसपास के अंगों शामिल हैं। Superecliptic pHluorin (सितम्बर) GFP का पीएच संवेदनशील संस्करण है। आनुवंशिक रूप से ब्याज की एक झिल्ली प्रोटीन के बाह्य क्षेत्र में सितम्बर एन्कोडिंग पर fluorophore पदोंईआर की और सेल के बाह्य क्षेत्र में ल्यूमिनल ओर। जब पीएच 6 से अधिक है सितम्बर फ्लोरोसेंट है, लेकिन कम पीएच मान पर एक बंद राज्य में रहता है। इसलिए, (प्रधानमंत्री) प्लाज्मा झिल्ली में जालिका (ईआर) में या प्रविष्टि पर जब रह लेकिन जब एक की तस्करी पुटिका या ऐसे Golgi के रूप में अन्य अंगों तक ही सीमित नहीं सितम्बर प्रतिदीप्ति के साथ टैग रिसेप्टर्स। बाह्य पीएच प्लाज्मा झिल्ली पर रिसेप्टर्स के प्रतिदीप्ति हुक्म को समायोजित किया जा सकता है। एक ही सेल के लिए तटस्थ और अम्लीय कोशिकी पीएच पर TIRF छवियों के बीच प्रतिदीप्ति में अंतर प्लाज्मा झिल्ली पर रिसेप्टर्स के एक रिश्तेदार नंबर से मेल खाती है। इस intracellular और प्लाज्मा झिल्ली निवासी रिसेप्टर्स की एक साथ माप की अनुमति देता है। एकल पुटिका प्रविष्टि घटनाओं को भी जब बाह्य पीएच तटस्थ है, एक कम पीएच की तस्करी पुटिका प्लाज्मा झिल्ली के साथ fusing और एक फ्लोरोसेंट राज्य में संक्रमण के लिए इसी मापा जा सकता है। इस versatilई तकनीक स्थानीयकरण, अभिव्यक्ति, और झिल्ली प्रोटीन की तस्करी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

Introduction

रिसेप्टर अभिव्यक्ति, वितरण, और विधानसभा में परिवर्तन अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, सिस्टिक फाइब्रोसिस, और मादक पदार्थों की लत 1, 2, 3, 4, 5 सहित रोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए जोड़ा गया है। उदाहरण के लिए, निकोटीन और अन्य निकोटिनिक ligands निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स (nAChRs) की तस्करी, अभिव्यक्ति, और अपरेगुलेशन 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 में परिवर्तन के लिए अग्रणी की तस्करी को प्रभावित करती है। निकोटीन एक कोशिका के भीतर इकट्ठे nAChRs की कुल संख्या बढ़ जाती है, प्लाज्मा झिल्ली की ओर की तस्करी बढ़ जाती है, एकडी कुछ उपप्रकार के एक उच्च संवेदनशीलता संस्करण के पक्ष में सब यूनिटों के विधानसभा बदल। एक रोग मॉडल में तस्करी, विधानसभा, और रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति में विशिष्ट परिवर्तन के समाधान के लिए महत्वपूर्ण यंत्रवत जानकारी है कि नशीली दवाओं के लक्ष्यों को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं प्रदान करता है। एक आदर्श दृष्टिकोण तेजी से intracellular रिसेप्टर्स और प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीय लोगों के बीच अंतर होता है। इस मामले हैं, जहां एक विशेष प्रोटीन का बहुमत इस तरह के nAChRs के साथ के रूप intracellularly रहता है, में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है। चूंकि nAChRs के बहुमत जालिका के लिए स्थानीय कर रहे हैं, पारंपरिक माप स्रावी मार्ग के साथ स्थानीयकरण और तस्करी परिवर्तन इंगित करने के लिए स्थानिक-अस्थायी समाधान के लिए आवश्यक की कमी है। NAChRs के रिसेप्टर की तस्करी और अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए मुख्य रूप से बाध्यकारी 11 radioligand, biotinylation assays के 12, पश्चिमी सोख्ता 13, या immunoprecipitation techniq का उपयोग कर आयोजित किया गया है ues 12। ये एक संवाददाता अणु या कोशिकाओं के निर्धारण के बंधन विशिष्टता पर निर्भर करते हैं और एक साथ प्लाज्मा झिल्ली निवासी और intracellular रिसेप्टर्स के बीच भेद करने की क्षमता की कमी है। इसलिए, आयन चैनल विधानसभा और पुटिका गतिशीलता की पढ़ाई काफी हद तक कम throughput electrophysiological तकनीकों 14 पर भरोसा किया है।

सुपीरियर स्थानिक और लौकिक संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के क्षेत्र में प्रगति के साथ संभव है। ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और इसके वेरिएंट के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संवाददाता अणुओं, अविशिष्ट बंधन के मुद्दों को खत्म करने और संवेदनशीलता 15 वृद्धि हुई है। GFP के एक पीएच संवेदनशील संस्करण, superecliptic pHluorin (सितम्बर) के रूप में जाना जाता है, स्थानीयकरण 5, 7, 8 निर्धारित करने के लिए एक कोशिका के भीतर डिब्बों के बीच निहित पीएच मतभेद का फायदा उठाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैरेफरी "> 9, 16, 17, 18। सितम्बर fluoresces जब पीएच 6 से अधिक है, लेकिन कम पीएच पर एक बंद राज्य में रहता है। इसलिए, उनके ल्यूमिनल तरफ सितम्बर के साथ टैग रिसेप्टर्स जब जालिका में मौजूद पता चला रहे हैं ( ईआर) या प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) में प्रविष्टि पर नहीं, लेकिन जब एक की तस्करी पुटिका तक ही सीमित। प्लाज्मा झिल्ली पर रिसेप्टर्स के साथ संपर्क में बाह्य पीएच के हेरफेर फलस्वरूप प्रतिदीप्ति और इसलिए इन रिसेप्टर्स का पता लगाने के बदल। एक ही सेल हैं क्रमिक रूप से दोनों एक तटस्थ पीएच बाह्य और फिर एक पीएच 6 से कम पर imaged है, छवियों के बीच अंतर प्लाज्मा झिल्ली पर स्थित रिसेप्टर्स करने के लिए जिम्मेदार ठहराया है। यह intracellular का एक साथ माप (परिधीय ईआर) और प्लाज्मा झिल्ली निवासी रिसेप्टर्स 5 की अनुमति देता है, 7, 8 p>, 9। एकल पुटिका प्रविष्टि घटनाओं को भी जब बाह्य पीएच तटस्थ है सुलझाया जा सकता है। एक बार एक कम पीएच की तस्करी पुटिका प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़, पुटिका के ल्यूमिनल पक्ष तटस्थ कोशिकी समाधान से अवगत कराया है, एक संक्रमण प्रतिदीप्ति 7, 18, 19, 20 के एक पटाखे के रूप में पहचान के कारण। सितम्बर प्लाज्मा झिल्ली और परिधीय जालिका के लिए स्थानीय रिसेप्टर्स की माप के लिए सक्षम बनाता है, और इन क्षेत्रों subcellular 5, 7, 18 के बीच रिसेप्टर्स की तस्करी को मापने के लिए एक साधन प्रदान करता है।

प्लाज्मा झिल्ली पर उच्च संकल्प को प्राप्त करने के लिए, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सितम्बर के साथ एक रिसेप्टर कुल आंतरिक प्रतिबिंब पुष्पन माइक्रोस्कोपी (TIRFM) से ली गई है। इस विधि को विशेष रूप से हैउपयोगी रिसेप्टर्स के बहुमत intracellular क्षेत्रों के लिए स्थानीय कर रहे हैं, के बाद से TIRFM प्लाज्मा झिल्ली की दृश्यता बढ़ जाती है। TIRFM भी PM में प्रविष्टि पर सितम्बर लेबल रिसेप्टर्स को ले जाने के एकल पुटिकाओं की तस्करी गतिशीलता का संकल्प सक्षम बनाता है। कुल आंतरिक प्रतिबिंब इस तरह के एक सेल और एक गिलास को कवर पर्ची 21, 22 के बीच के रूप में विभिन्न अपवर्तक सूचकांक, के साथ सामग्री के इंटरफेस पर होता है। सितम्बर fluoresces जब 488 एनएम उत्तेजना, जो कांच और सेल के समाधान के इंटरफेस में कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्राप्त करने के लिए उन्मुख है के साथ विकिरणित। यह एक क्षणभंगुर लहर कि नमूना, इस मात्रा के भीतर ही रोमांचक fluorophores में लगभग 150 एनएम प्रवेश पैदा करता है। केवल उत्तेजना की इस सीमा के भीतर एक तटस्थ पीएच वातावरण में रिसेप्टर्स युक्त सितम्बर पता चला रहे हैं, प्लाज्मा झिल्ली या परिधीय जालिका पर रहने वाले उन लोगों के लिए इसी। चूंकि पता लगाने सीमित टी हैक्षणभंगुर लहर, intracellular क्षेत्र से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति द्वारा ओ उत्तेजना कम हो जाता है और शोर अनुपात करने के लिए संकेत 21 की वृद्धि हुई है, 22। इसके अलावा, विकिरण सेल के थोक घुसना नहीं करता है के बाद से, photodamage कम से कम जो समय के पाठ्यक्रम पर लाइव सेल इमेजिंग की अनुमति देता है। नतीजतन, TIRFM आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सितम्बर उच्च संकल्प और संवेदनशीलता स्रावी मार्ग के साथ झिल्ली रिसेप्टर्स की subcellular स्थानीयकरण और अवैध व्यापार की गतिशीलता को मापने के लिए आवश्यक प्रदान करता है के साथ मिलकर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल संस्कृति और अभिकर्मक

  1. विकास मीडिया में माउस neuroblastoma 2A (N2a) कोशिकाओं को बनाए रखें।
    1. 200 मिलीलीटर Dulbecco के ईगल मध्यम (DMEM) उच्च ग्लूकोज के साथ से 500 मिलीलीटर N2a विकास मीडिया बनाओ, 250 मिलीलीटर सीरम मीडिया, 50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) कम है, और 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100x)।
    2. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक T75 फ्लास्क में कोशिकाओं को बनाए रखें।
    3. विभाजन कोशिकाओं 01:15 जब आवश्यक हो, या कम से लगभग 80-90% confluency। यह आम तौर पर 2-3 बार एक सप्ताह है।
  2. कोट 35 मिमी गिलास पाली डी lysine के साथ नीचे पकवान।
    1. एक लामिना का प्रवाह जैव सुरक्षा कैबिनेट में, बाँझ 35 मिमी पकवान की गिलास नीचे क्षेत्र पर 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल पाली डी lysine के 200 μl जोड़ें।
    2. 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पकवान रखें।
    3. ध्यान से 2 ओ 3-4 बार DDH के साथ पकवान कुल्ला।
    4. बर्तन को पूरी तरह से अधिक से अधिक 1 घंटे के लिए सूखी अनुमति दें।
    5. sTERILजैव सुरक्षा कैबिनेट में पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग कर यदि आवश्यक बर्तन ize।
  3. TIRFM इमेजिंग के लिए N2a कोशिकाओं थाली।
    1. पक्षपाती कोशिकाओं से विकास मीडिया निकालें।
    2. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर 1x trypsin 5 मिनट के लिए (+ EDTA) के साथ incubating द्वारा कुप्पी से कोशिकाओं को अलग करें।
    3. 9 मिलीलीटर विकास मीडिया जोड़कर trypsin निष्क्रिय। मीडिया, trypsin, और अलग कोशिकाओं एक पिपेट का उपयोग कर मिलाएं।
    4. नेत्रहीन एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती और प्रत्येक पाली डी lysine लेपित गिलास नीचे डिश के लिए 90,000 कोशिकाओं को जोड़ने के लिए सही मात्रा की गणना। यह घनत्व कुशल अभिकर्मक और एकल कक्ष TIRF इमेजिंग के लिए आवश्यक है।
    5. प्रत्येक गिलास नीचे 90,000 कोशिकाओं से युक्त डिश के लिए 2 मिलीलीटर विकास मीडिया जोड़ें।
    6. 16-24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते हैं।
  4. N2a अभिकर्मक
    1. एक प्लाज्मिड एक सितम्बर fluorophore शामिल युक्त निर्माण प्राप्तब्याज की प्रोटीन के बाह्य क्षेत्र में। ऐसे पीसीआर प्रवर्धन के रूप में 5 मानक क्लोनिंग तकनीक का निर्माण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: SEP झिल्ली प्रोटीन के बाह्य क्षेत्र में शामिल किया जाना चाहिए ताकि यह जालिका या तस्करी के पुटिकाओं के लुमेन के भीतर रहता है और जब प्लाज्मा झिल्ली पर कोशिकी समाधान से अवगत कराया है। सितम्बर आकार में समान करने के लिए GFP और इसी तरह की क्लोनिंग रणनीतियों इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. 1.5 मिलीलीटर कम हो सीरम मीडिया के साथ चढ़ाया कोशिकाओं पर विकास मीडिया बदलें (जैसे, ऑप्टी सदस्य), लगभग 30 मिनट अभिकर्मक अभिकर्मक के अलावा पहले।
      ध्यान दें: रिसेप्टर्स में दवा प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए, दवा का एक उपयुक्त एकाग्रता अभिकर्मक के समय में जोड़ा जा सकता है।
    3. प्रत्येक वांछित प्लाज्मिड के 500 एनजी जोड़े 250 μl करने के लिए निर्माण के लिए कम सीरम मीडिया (ट्यूब 1)।
    4. एक अलग ट्यूब ग के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के 2 μl जोड़ेकम हो सीरम मीडिया के ontaining 250 μl। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब 2 सेते हैं। अभिकर्मक अभिकर्मक के अनुपात से डीएनए प्लाज्मिड के लिए ब्याज की प्रत्येक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    5. नलियों 1 और 2 का मिश्रण एक समाधान अभिकर्मक अभिकर्मक और प्लाज्मिड मिश्रण के 500 μl युक्त बनाने के लिए। 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    6. पकवान प्रति 2 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए 500 μl अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए पूर्व चढ़ाया कोशिकाओं जोड़ें।
    7. 24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
    8. 24 घंटे के बाद, अभिकर्मक मिश्रण को दूर करने और विकास मीडिया के साथ कोशिकाओं कुल्ला और फिर प्रत्येक पकवान विकास मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: एक दवा अभिकर्मक के समय में जोड़ा गया है, तो यह इस कदम पर फिर से मंगाया जा सकता है।
    9. 24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
    10. छवि कोशिकाओं अभिकर्मक के बाद 48 घंटा।

कुल में से 2. लाइव सेल इमेजिंगternal प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM)

  1. इमेजिंग की स्थापना
    1. चित्र 1 में दिखाया गया है एक स्कैनिंग मंच के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी सेट-अप के साथ इमेजिंग प्रदर्शन। यह एक 488 एनएम DPSS लेजर स्रोत के संरेखण की आवश्यकता है, एक stepper मोटर 488 एनएम किरण स्थिति, और एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (1.49 एनए) 60X या 100X तेल विसर्जन उद्देश्य को समायोजित करने के लिए।
    2. उचित उत्तेजना फिल्टर (bandpass 488/10 एनएम) के माध्यम से लेजर बीम गुजरती हैं। एक लांचर एक stepper मोटर के लिए मुहिम शुरू से जुड़ा एक एकल मोड फाइबर के माध्यम से ध्रुवीकरण लेजर बीम संरेखित करें। epifluorescence मोड में, उत्तेजना बीम उद्देश्य के पीछे एपर्चर के बीच में केंद्रित है।
    3. TIRF पाने, उद्देश्य लेंस के पीछे एपर्चर भर में लेजर बीम ध्यान केंद्रित अनुवाद करने के लिए stepper मोटर का उपयोग जब तक महत्वपूर्ण कोण तक पहुँच जाता है और बीम नहीं रह नमूना के माध्यम से फैलता है और इसके बजाय पूरी तरह से कांच-सेल बंद परिलक्षित होता हैएल इंटरफेस।
    4. (525/50) एनएम उचित उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक EMCCD (512 x 512 पिक्सल) इमेजिंग सॉफ्टवेयर (जैसे Metamorph) के साथ नियंत्रित का उपयोग कर छवियों पर कब्जा उत्सर्जन मार्ग में मुहिम शुरू की।
  2. इमेजिंग समाधान तैयार
    1. DDH में 150 मिमी NaCl, 4 मिमी KCl, 2 मिमी MgCl 2, 2 मिमी CaCl 2, 10 मिमी HEPES और 10 मिमी ग्लूकोज मिलाकर 200 मिलीलीटर कोशिकी समाधान (ईसीएस) तैयार 2 ओ स्टॉक समाधान NaCl, KCl, 2 MgCl, और 2 CaCl पहले से तैयार और ताजा HEPES और इमेजिंग के दिन पर ग्लूकोज के साथ जोड़ा जा सकता है।
    2. एक समाधान 7.4 पीएच 100 मिलीलीटर ईसीएस युक्त का पीएच को समायोजित करें। 5.4 का पीएच को ईसीएस के शेष 100 मिलीलीटर समायोजित करें। (7.4 पीएच) ईसीएस के 2 मिलीलीटर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं कुल्ला।
    3. इमेजिंग से पहले ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए ईसीएस के 2 मिलीलीटर (7.4 पीएच) जोड़ें।
  3. TIRF में लाइव सेल इमेजिंग
    1. पूरे सिस्टम को चालू करें, includinजी 488 एनएम लेजर, कैमरा, अनुवाद चरण, और इमेजिंग प्रोग्राम। epifluorescence बीम फोकस और 60x उद्देश्य से लगभग 1 मेगावाट बिजली समायोजित करें।
    2. उद्देश्य के लिए तेल जोड़ें और अनुवाद मंच पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का एक पकवान जगह है। मंच का उपयोग कर आरोह को सुनिश्चित करने के लिए यह चरण के लिए सम्मान के साथ कदम नहीं करता है तो कोशिकाओं को कई बार imaged किया जा सकता जगह में पकवान सुरक्षित।
    3. epifluorescence मोड में, माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित करने और फ्लोरोसेंट, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का पता लगाने। प्रकोष्ठों कई फोकस विमानों भर में ध्यान केंद्रित रहेगा। TIRF के साथ आगे बढ़ने के लिए एकल, अलग कक्षों का पता लगा।
    4. इमेजिंग प्रोग्राम में, 200 मिसे के लिए जोखिम समय निर्धारित करने और ईएम लाभ की स्थापना करके प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुकूलन।
    5. एक stepwise तरीके से उद्देश्य भर में किरण का अनुवाद stepper मोटर का उपयोग करके TIRF में लेजर बीम को संक्रमण। महत्वपूर्ण कोण दृष्टिकोण के रूप में, किरण दिख पकवान के किनारे भर में अनुवाद करेंगे जब तक यह वें पर convergesनमूना विमान पर कुल आंतरिक प्रतिबिंब के ई बिंदु।
    6. सत्यापित करें कि कोशिकाओं ध्यान केंद्रित घुंडी का समायोजन करके TIRF मोड में हैं। TIRF में, कोशिकाओं का केवल एक ही विमान केंद्रित किया जा सकता (कांच इंटरफ़ेस से यानी लगभग 150 एनएम), प्लाज्मा झिल्ली के उच्च संकल्प के साथ एक बहुत ही परिभाषित की छवि का निर्माण किया।
  4. इमेजिंग सितम्बर subcellular स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए
    1. इमेजिंग विमान में स्वस्थ, ट्रांसफ़ेक्ट, एकल कक्षों का पता लगा।
    2. 7.4 पीएच पर सेल का ध्यान केंद्रित छवि मोल। सितम्बर प्लाज्मा झिल्ली और जालिका पर रिसेप्टर्स लेबल दिखाई जानी चाहिए।
    3. जल्दी photobleaching को रोकने के लिए नमूना पहुंचने से लेजर बीम ब्लॉक।
    4. माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर एकाधिक XY स्थानों रिकॉर्डिंग में सक्षम का उपयोग कर प्रत्येक कक्ष के लिए इसी चरण पदों पर याद।
    5. दोहराएँ कदम 2.4.1-2.4.4 पकवान प्रति 20-30 कोशिकाओं के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करते समय प्रत्येक कोशिका की स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए।
    6. वायु सेनाआतंकवाद पीएच 7.4 से सभी सेल छवियों एकत्र कर रहे हैं, मैन्युअल पीएच 7.4 ईसीएस समाधान के लिए एक पिपेट का उपयोग कर हटा दें। डिश को छूने यह याद मंच पदों पर स्थानांतरित कर सकता है के रूप में नहीं है।
    7. ध्यान से डिश के लिए पीएच 5.4 ईसीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें। इस समय के दौरान, पहले अधिग्रहीत छवियों को बचा लो।
    8. 7.4 पीएच पर छवियों को इकट्ठा करने, प्रत्येक बचाया स्थिति के लिए मंच के लिए कदम और पीएच 5.4 पर एक ही सेल की एक छवि प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल की स्थिति के समान सेट के तहत। प्रकोष्ठों के बाद से सभी का पता चला प्रतिदीप्ति लेबल रिसेप्टर्स सीमित सितम्बर जालिका से होने वाले है कम परिभाषित दिखना चाहिए। पीएच 5.4 सेल छवियों को बचाओ।
  5. जीवित कोशिकाओं में इमेजिंग एकल पुटिका प्रविष्टि घटनाओं
    1. 2 मिलीलीटर 7.4 पीएच ईसीएस के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के विकास को मीडिया बदलें, या लेबोविट्ज़ एल 15 मीडिया के साथ। लेबोविट्ज़ एल -15 मीडिया के पीएच सीओ 2 स्वतंत्र है, इमेजिंग समय की एक लंबी अवधि में जगह लेने के लिए यदि आवश्यक अनुमति देता है।
    2. Placमाइक्रोस्कोप के मंच पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के पकवान ई। सुरक्षित और TIRF में ऊपर 2.3 कदम के बाद एक एकल कोशिका ध्यान केंद्रित।
    3. अगर सुसज्जित, ऑटोफोकस इतना तय फोकस इमेजिंग की अवधि में बहाव नहीं करता है।
    4. 1,000 फ्रेम की एक श्रृंखला रिकॉर्ड, लगातार 200 मिसे के एक फ्रेम दर पर छवियों पर कब्जा। प्रतिदीप्ति के फटने इस समय के दौरान दिखाई जाएगी, कम पीएच की तस्करी प्लाज्मा झिल्ली के साथ fusing पुटिकाओं के लिए इसी, बाह्य पीएच 7.4 सितम्बर को उजागर।
    5. एक और एकल कक्ष का पता लगाएँ और ऊपर चरण दोहराएँ। ऑटोफोकस रीसेट यदि आवश्यक है।

3. छवि विश्लेषण और डाटा प्रोसेसिंग

  1. सितम्बर प्रतिदीप्ति का विश्लेषण subcellular स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए
    1. सेल ऐसे Metamorph या ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) के रूप में एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को खोलें। दोनों 5.4 पीएच और पीएच 7.4 छवियों से पृष्ठभूमि घटाना गेंद रोलिंग सेटिंग का उपयोग।
    2. एक एकल कोशिका से प्रतिदीप्ति यों तो एक तीव्रता के आधार पर सीमा का प्रयोग करें। मैन्युअल पीएच 7.4 छवि में सेल के आसपास ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करें।
    3. सेल क्षेत्र को मापने, तीव्रता मतलब है, और ImageJ में एक प्लगइन का उपयोग कर एकीकृत घनत्व या विश्लेषण टैब के अंतर्गत "उपाय" समारोह में बनाया का उपयोग कर।
    4. पीएच 5.4 पर एक ही सेल के लिए कदम 3.1.1-3.1.3 दोहराएँ, ध्यान से तीव्रता के आधार पर सीमा और एक ही तरीके से ब्याज के क्षेत्र का समायोजन।
    5. बाद एकीकृत घनत्व दोनों 7.4 पीएच और 5.4 पर सेल छवियों के लिए प्राप्त की है, 7.4 पीएच मूल्य से पीएच 5.4 मूल्य घटा कर प्लाज्मा झिल्ली एकीकृत घनत्व की गणना। अंतर TIRF उत्तेजना क्षेत्र के भीतर प्लाज्मा झिल्ली पर रिश्तेदार नंबर रिसेप्टर्स से मेल खाती है।
    6. तस्करी के एक उपाय के रूप में गणना सितम्बर के रिश्तेदार प्रतिशत TIRF excitati में दिखाई शेष रिसेप्टर्स की तुलना में लेबल प्लाज्मा झिल्ली पर स्थित रिसेप्टर्स7.4 पीएच पर कुल एकीकृत घनत्व द्वारा एकीकृत घनत्व प्लाज्मा झिल्ली, 100 से गुणा विभाजित करके मात्रा पर।
  2. एकल पुटिका प्रविष्टि की घटनाओं का विश्लेषण
    1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 1,000 झगड़ा छवियों की श्रृंखला खोलें। रोलिंग गेंद सेटिंग का उपयोग कर सभी फ्रेम से पृष्ठभूमि घटाएँ।
    2. प्रविष्टि घटनाओं पुटिका के लिए इसी तीव्र क्षेत्रों को अधिकतम करने के लिए रिकॉर्डिंग का रंग संतुलन को समायोजित करें। मैन्युअल स्थायी अब से 3 फ्रेम (> 600 मिसे) प्रतिदीप्ति के फटने गिनती।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक रिसेप्टर में सितम्बर समावेश एक जीवित कोशिका में है कि रिसेप्टर के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है। TIRFM के साथ युग्मित, इस प्लाज्मा झिल्ली और TIRF उत्तेजना के क्षेत्र में subcellular स्थानों में रिसेप्टर्स के वितरण पर रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर के मूल्यांकन की अनुमति देता है। एकल पुटिका तस्करी घटनाओं को भी हल किया जा सकता है।

प्लाज्मा झिल्ली पर सितम्बर लेबल रिसेप्टर्स की रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर

उत्तेजना पर सितम्बर प्रतिदीप्ति आसपास के समाधान के पीएच से निर्धारित होता है। सितम्बर प्लाज्मा झिल्ली निवासी रिसेप्टर्स के साथ जुड़े हुए है, जब बाह्य पीएच पर या 5, 7, 8, 9, 17 बंद इस प्रतिदीप्ति चालू करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है। कबकोशिकी समाधान के ई पीएच एक शारीरिक 7.4, दोनों प्लाज्मा झिल्ली और TIRF उत्तेजना प्रतिदीप्ति के क्षेत्र के भीतर जालिका से रिसेप्टर्स। बाह्य समाधान तो पीएच 5.4 की एक अन्यथा समान समाधान के साथ आदान-प्रदान किया जा सकता है। यह प्लाज्मा झिल्ली निवासी सितम्बर एक बंद राज्य में संक्रमण का कारण बनता है, जिसका अर्थ है सभी मनाया प्रतिदीप्ति जालिका से अब है। चित्रा 2 दोनों पीएच 7.4 (ए) और पीएच 5.4 (बी) पर imaged कोशिकाओं का एक उदाहरण दिखाता है। प्लाज्मा झिल्ली TIRF उत्तेजना के क्षेत्र के भीतर परिधीय जालिका की तुलना पर रिसेप्टर्स के रिश्तेदार संख्या तो 7.4 पीएच, चित्रा -2 में प्रतिनिधित्व पर उस से 5.4 पीएच पर प्रतिदीप्ति की एकीकृत घनत्व को घटाकर गणितीय गणना की जाती है। यह गणना प्लाज्मा झिल्ली एकीकृत घनत्व सितम्बर लेबल प्लाज्मा झिल्ली पर स्थित रिसेप्टर्स के रिश्तेदार नंबर करने के लिए और TIRF उत्तेजना के भीतर से मेल खाती हैमात्रा। चूंकि प्लाज्मा झिल्ली और आसपास के परिधीय जालिका TIRF के साथ रियायत के लिए उत्साहित किया जा रहा है, इस subcellular वितरण तुलना इन क्षेत्रों के लिए स्थानीय रिसेप्टर्स के बीच है, और न सेल की पूरी intracellular क्षेत्र।

सितम्बर लेबल रिसेप्टर्स की subcellular वितरण

रिसेप्टर्स की तस्करी जालिका की तुलना में प्लाज्मा झिल्ली पर स्थित रिसेप्टर्स के बीच अनुपात की तुलना द्वारा मापा जा सकता है। 7.4 पीएच पर कुल एकीकृत घनत्व द्वारा एकीकृत घनत्व प्लाज्मा झिल्ली, 100 से गुणा डिवाइडिंग, सितम्बर लेबल प्लाज्मा झिल्ली 5, 7 पर स्थित रिसेप्टर्स के एक रिश्तेदार प्रतिशत देता है। एक नियंत्रण के रूप में, एक brefeldin intracellular प्रोटीन की तस्करी को बाधित करने की कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है। जब brefeldin एक वर्तमान, वस्तुतः है पता लगाया rece के सभीTIRF उत्तेजना के क्षेत्र के भीतर ptors एक कम% PM, जिसके परिणामस्वरूप जालिका तक ही सीमित हो जाएगा। इसके अतिरिक्त, उत्परिवर्तित (Δ508-I539T) सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane नियामक (Δ508-I539T-CFTR) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। 2 से 3 गुना करने के लिए कोशिका की सतह बढ़ जाती है पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध VX-809, Δ508-I539T-CFTR अभिव्यक्ति की उपस्थिति में।

एकल पुटिका निवेशन आयोजन

सितम्बर प्रतिदीप्ति नहीं है या एक परिवहन पुटिका के कम पीएच में photobleach, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली 7, 16, 18 में 7.4 की एक बाह्य पीएच के लिए जोखिम पर प्रतिदीप्ति आएगा। निवेशन घटनाओं, प्लाज्मा झिल्ली में प्रतिदीप्ति का एक फट स्थायी कम से कम 3 फ्रेम (600 मिसे) के रूप में कल्पना कर रहे हैं प्लाज्मा झिल्ली में परिवहन पुटिका से भरा संलयन के लिए इसी, चित्रा 3 में दिखाया गया है। एक प्रविष्टि (3B चित्रा) से पहले, कोई discernable फट मौजूद है। - (3 जी चित्रा 3 डी) सेल (चित्रा 3H - 3I) के थोक प्रतिदीप्ति में शामिल जब तक प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि के रूप में परिवहन पुटिका आता है (चित्रा 3 सी), झिल्ली भर diffusing देखा जाता है।

आकृति 1
चित्रा 1: TIRF माइक्रोस्कोप के योजनाबद्ध। इस TIRF सेटअप सितम्बर उत्तेजना, फाइबर एक stepper मोटर करने के लिए मिलकर उद्देश्य के पीछे एपर्चर भर में किरण का अनुवाद करके उत्तेजना बीम का महत्वपूर्ण कोण समायोजित करने के लिए एक 488 एनएम DPSS लेजर का इस्तेमाल करता है। प्रकोष्ठों एक 60X 1.49 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग imaged हैं। उत्सर्जन एक इलेक्ट्रॉन गुणा प्रभारी युग्मित डिवाइस का उपयोग कर पता लगाया है।फ़ाइलें / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: अभिव्यक्ति और प्लाज्मा झिल्ली पर तस्करी। एक N2a सेल पीएच 7.4 (ए) में α3-Sep / β4-WT nAChRs व्यक्त प्लाज्मा झिल्ली और जालिका पर स्थित रिसेप्टर्स से पता चलता है। 5.4 पीएच (बी), प्लाज्मा झिल्ली पर रिसेप्टर्स प्रतिदीप्ति नहीं है, इसलिए केवल जालिका निवासी रिसेप्टर्स दिखाई दे रहे हैं। पीएच 7.4 और पीएच 5.4 (सी) में एकीकृत घनत्व के बीच अंतर प्लाज्मा झिल्ली के लिए स्थानीय रिसेप्टर्स से मेल खाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3: एकल पुटिका निवेशन घटना। एक N2a सेल एक बाह्य पीएच 7.4 के साथ α3-Sep / β4-WT nAChRs व्यक्त (ए) में दिखाया गया है। इसके तत्काल बाद एक प्रविष्टि (बी) के पूर्ववर्ती, प्रतिदीप्ति का कोई फट दिख रहा है। सितम्बर ले जाने के एक अवैध व्यापार पुटिका (सी) आता है, और सितम्बर लेबल रिसेप्टर्स प्लाज्मा झिल्ली भर में फैलाना (डी - जी) पहले से डाला रिसेप्टर्स से, पृथक तक (एच - मैं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सितम्बर के पीएच संवेदनशीलता सक्षम बनाता प्लाज्मा झिल्ली पर रहने वाले रिसेप्टर्स जालिका में intracellular रिसेप्टर्स से प्रतिष्ठित किया जा रहा है, और यह की प्रविष्टि की घटनाओं को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता रिसेप्टर को ले जाने पुटिकाओं 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 । सतह biotinylation और ligand सहित कई तकनीकों बंधन व्यापक रूप से प्रोटीन की सतह के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। कुछ मामलों में, पश्चिमी blots भी ईआर और प्रधानमंत्री निवासी प्रोटीन के बीच भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह सितम्बर आधारित तकनीक सतह अभिव्यक्ति की एक तेजी से readout और प्रधानमंत्री को ईआर पर स्थानीय प्रोटीन में बदलाव यों करने की क्षमता प्रदान पारंपरिक माप के लिए पूरक है। सितम्बर के बाद से आनुवंशिक रूप से ब्याज की प्रोटीन में इनकोडिंग है, nonspe के साथ मुद्दोंcific बंधन समाप्त हो जाते हैं और संवेदनशीलता बढ़ जाती है। सितम्बर तटस्थ पीएच पर 488 एनएम उत्तेजना से होकर गुजरती है, लेकिन पीएच <6 के अम्लीय परिस्थितियों में उत्साहित नहीं है। जब बाह्य पीएच 7.4, प्रतिदीप्ति जालिका में और प्लाज्मा झिल्ली पर रहने वाले nAChRs के लिए मापा जाता है, लेकिन नहीं कम पीएच स्रावी पुटिकाओं या Golgi में उन लोगों के लिए (पीएच <6) 23। इमेजिंग के दौरान, पीएच 7.4 से 5.4 पीएच ईसीएस पर एक अन्यथा समान समाधान के लिए आदान-प्रदान किया जाता है। इन छवियों में एकीकृत घनत्व के बीच का अंतर एक सेल के प्लाज्मा झिल्ली घनत्व एकीकृत है। 7.4 पीएच, 100 से गुणा पर TIRF उत्तेजना के क्षेत्र के भीतर कुल एकीकृत घनत्व से इस संख्या में विभाजित, प्लाज्मा झिल्ली 5, 7, 8, 9 पर प्रतिशत देता है। इन अध्ययनों TIRFM का इस्तेमाल किया है, जबकि इसी तरह के assays महामारी प्रतिदीप्ति का उपयोग किया जा सकता है।nAChR तरह झिल्ली रिसेप्टर्स जहां रिसेप्टर्स के बहुमत ईआर में रहते हैं के लिए, TIRM आदर्श क्योंकि संकीर्ण उत्तेजना मात्रा intracellular रिसेप्टर्स बनाम दिखाई PM निवासी रिसेप्टर्स के अंश बढ़ जाती है। यह अंगों के बीच रिसेप्टर वितरण में बदलाव करने के लिए परख की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। प्रधानमंत्री उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के साथ प्रोटीन के लिए, महामारी प्रतिदीप्ति आधारित सितम्बर अध्ययनों रिसेप्टर अभिव्यक्ति में परिवर्तन को मापने के लिए पर्याप्त हैं। हालांकि, एकल पुटिका प्रविष्टि घटनाओं जो भी 7.4 पीएच पर मापा जाता है TIRFM की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति के फट कम पीएच की तस्करी पुटिका उच्च पीएच प्लाज्मा झिल्ली के साथ fusing जबकि आसानी से TIRFM में देखा आमतौर पर महामारी प्रतिदीप्ति में discernable नहीं है के लिए इसी।

TIRF इमेजिंग शर्तों के साथ सितम्बर को शामिल

सितम्बर आनुवंशिक रूप से एक झिल्ली प्रोटीन के बाह्य डोमेन में शामिल किया जा सकता है। आकार और सितम्बर के स्थान के कारण, यह Verif के लिए महत्वपूर्ण है y कि संशोधित प्रोटीन काफी एक जंगली प्रकार के प्रोटीन से तस्करी या समारोह में अलग नहीं है। Assays का उपयोग सितम्बर लेबल प्रोटीन लेबल की कि समावेश सत्यापित करने के लिए गतिविधि को बाधित नहीं किया प्रदर्शन किया जाना चाहिए। आयन चैनलों के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और आयन पारगम्यता माप, जबकि अन्य रिसेप्टर्स के लिए फ्लोरोसेंट ligand बंधन और पश्चिमी सोख्ता की तस्करी सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आदर्श होते हैं। पक्षपाती कोशिकाओं आदर्श TIRFM के साथ वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ अभिकर्मक और इमेजिंग के लिए अनुकूल है, क्योंकि वे गिलास नीचे डिश के लिए सीधे संलग्न कर रहे हैं। यह लगाव गिलास नमूना इंटरफ़ेस से लगभग 150 एनएम के भीतर सुनिश्चित करने के लिए TIRF उत्तेजना क्षणभंगुर लहर द्वारा आवश्यक है। उच्च संकल्प TIRF छवियों को प्राप्त करने के लिए, नमूना इमेजिंग 21 के दौरान सपाट रहने की जरूरत है। पाली-डी lysine कोटिंग फायदेमंद जब इमेजिंग N2a कोशिकाओं क्योंकि यह एक लगाव मैट्रिक्स है कि सेल आंदोलनों को कम करता है एक सपाट सतह बनाए रखने के लिए प्रदान करता हैलड़की = "xref"> 7। चढ़ाना सेल घनत्व सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं गिलास पकवान पर अलग कर रहे हैं TIRF प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। सेल क्लस्टरिंग एक ऑप्टिकल विमान में फ्लैट सेल पालन को रोकने के द्वारा कुल आंतरिक प्रतिबिंब बाधा उत्पन्न करती है। चूंकि केवल एक ही विमान TIRF में ध्यान केंद्रित किया है, उचित सेल आकृति विज्ञान को बनाए रखने इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब समाधान सितम्बर अध्ययन में आदान-प्रदान किया जा रहा है। रूपात्मक परिवर्तन को कम करने के लिए, 7.4 पीएच और पीएच 5.4 पर छवियों को जल्दी से एकत्र होने की जरूरत है। इसके अलावा, ईसीएस (पीएच 5.4) अंततः intracellular झिल्ली चूना, organelle संरचना और आंतरिक सितम्बर लेबल रिसेप्टर्स की रोशनी में फेरबदल होगा। यह आसानी से कुछ ही मिनटों के भीतर प्रत्येक पीएच शर्त के तहत छवियों को इकट्ठा करके बचा है। एक ही इमेजिंग सत्र में कई व्यंजन से डेटा का विश्लेषण कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए जोड़ा जा सकता है। जब समाधान बदल रहा है, ध्यान से एक विंदुक के साथ 7.4 पीएच ईसीएस समाधान निकालने और पीएच 5.4 जोड़ने ईसीएस टी में dropwiseवह पकवान। हटाने या बहुत जल्दी समाधान जोड़ने कोशिकाओं तनाव या बचाया मंच पदों के लिए सम्मान के साथ पकवान स्थानांतरित कर सकते हैं। मुद्रा समाधान करने के लिए एक छिड़काव प्रणाली का भी उपयोग किया जा सकता है, समाधान विनिमय पूरा हो गया है और जल्दी होता है के रूप में लंबे समय के रूप में। प्रत्येक समाधान में सटीक नमक सांद्रता सेल विकृतियों को कम करने के लिए आवश्यक हैं। एक मंच शीर्ष इनक्यूबेटर तापमान में उतार चढ़ाव को कम करने के लिए इमेजिंग, जबकि शामिल किया जा सकता है।

TIRF इमेजिंग

TIRF इमेजिंग एक ऑप्टिकल विमान पर ध्यान केंद्रित करके पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम कर देता है। यह कांच नमूना इंटरफेस 21, 22 से लगभग 150 एनएम के भीतर चुनिंदा रोमांचक fluorophores द्वारा शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ जाती है। इस क्षेत्र के भीतर, संकल्प काफी वृद्धि हुई है, विशेष रूप से प्लाज्मा झिल्ली पर। यदि रिसेप्टर्स के बहुमत intracellularly स्थित हैं यह आवश्यक है। झिल्ली रिसेप्टर्स के एक उच्च अंश हैप्लाज्मा झिल्ली पर स्थित है, यह सितम्बर आधारित दृष्टिकोण epifluorescence में subcellular स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, अगर कुल रिसेप्टर्स की एक छोटा सा प्रतिशत प्लाज्मा झिल्ली को तस्करी कर रहे हैं, nAChRs साथ के रूप में, TIRFM आवश्यक प्लाज्मा झिल्ली में प्रतिदीप्ति में पीएच निर्भर परिवर्तन यों की है। इसके अलावा, TIRFM एकल पुटिका तस्करी की घटनाओं और स्रावी मार्ग के भीतर रिसेप्टर्स के वितरण के संकल्प की अनुमति देता है। एक बुनियादी TIRF सेटअप सितम्बर उत्तेजना, फाइबर एक stepper मोटर करने के लिए मिलकर उत्तेजना बीम का महत्वपूर्ण कोण समायोजित करने के लिए एक 488 एनएम DPSS लेजर कार्यरत हैं। TIR को प्राप्त करने के लिए, किरण उद्देश्य के पीछे एपर्चर भर laterally अनुवाद जब तक एक महत्वपूर्ण कोण तक पहुँच जाता है। प्रकोष्ठों एक 60x या 100x, 1.49 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग imaged हैं। नमूना (> कोशिकाओं के लिए 1.38) का अपवर्तनांक से अधिक एक संख्यात्मक एपर्चर TIRF के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कोण तक पहुँचने के लिए आवश्यक है। एक 1.45 NA उद्देश्य पर्याप्त होगा, लेकिन 1.49एनए अधिक व्यावहारिक जब उत्तेजना के कोण जोड़ तोड़ रहा है। उत्सर्जन 512 x 512 पिक्सल के एक 8 मिमी सरणी के साथ एक इलेक्ट्रॉन गुणा प्रभारी युग्मित डिवाइस (EMCCD) का उपयोग कर पता लगाया है। एक 60x उद्देश्य का प्रयोग, कई अलग कक्षों को देखने का एक क्षेत्र के भीतर कब्जा कर लिया जा सकता है।

प्रोटीन अभिव्यक्ति की आधारित अध्ययन प्रतिदीप्ति प्रमुख कमियां में से एक 15 photobleaching है। इस उत्तेजना समय पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक अपरिवर्तनीय कमी में fluorophore परिणामों के अपघटन प्रेरित किया। इस कारण से, सफल इमेजिंग EMCCD के भीतर इस्तेमाल उत्तेजना और पर चिप लाभ के बीम की तीव्रता के बीच एक नाजुक संतुलन पर निर्भर करता है। उत्तेजना तीव्रता का पता लगाने के लिए एक fluorophore उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त उच्च है, लेकिन इतनी अधिक नहीं तेजी से अणु photobleach के रूप में की जरूरत है। कैमरे के लाभ का पता लगाने के लिए संकेत गुणा करने के लिए, के रूप में बढ़ती उत्तेजना तीव्रता का विरोध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी पृष्ठभूमि बढ़ जाती हैtensity। इसके अलावा, ध्यान जब ईएम लाभ सेटिंग्स का चयन, छवियों की संतृप्ति से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। मापन के बीच में, उत्तेजना बीम अवरुद्ध होने से पहले पहुंचता है नमूना photobleaching कम करता है। जब 7.4 पीएच की एक ईसीएस पर सेल छवियों का संग्रह पीएच 5.4 करने के लिए तुलना करने के लिए यह आवश्यक है। Photobleaching दो छवियों के बीच होने वाली पीएच परिवर्तन के कारण प्रतिदीप्ति की कमी से पृथक है, इसलिए इस प्रभाव को कम से कम किया जाना चाहिए। जॉब कम लेजर शक्ति का उपयोग करने के लिए और केवल आवश्यक अवधि छवियों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक के लिए सेल का पर्दाफाश करने के लिए लिया जाना चाहिए। एक प्रयोग के लिए, कोशिकाओं का एक सेट के लिए एक नियंत्रण के रूप में समान इमेजिंग शर्तों के तहत 7 पीएच पर मापा जा सकता है। कोई अंतराल का प्रयोग और जोखिम समय परख प्रदर्शन के लिए आवश्यक मिलान अवधि के लिए प्रकाश में लाने के लिए एक नियंत्रण photobleaching की सीमा निर्धारित करने के लिए प्रदान करता है। photobleaching मूल तीव्रता का 10% से अधिक है, तो एक सुधार की अवस्था मनाया photobleaching चूहे से इस्तेमाल किया जा सकताप्रतिदीप्ति तीव्रता का एक समय का पता लगाने को इकट्ठा करके ई। एकल पुटिका प्रविष्टि घटनाओं के लिए, पुटिकाओं की तस्करी में सितम्बर लेबल रिसेप्टर्स प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूजन तक उत्साहित नहीं हैं, क्योंकि या तो पीएच एक बंद राज्य लगती हैं या वे उत्तेजना के TIRF क्षेत्र से बाहर हैं। इसलिए, सितम्बर में टैग रिसेप्टर्स प्रविष्टि तक photobleach नहीं होगा, की अनुमति उच्च उत्तेजना शक्ति आदेश एकल सितम्बर अणुओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

अंत में, इस तकनीक पक्षपाती सेल प्रकार की एक किस्म के साथ प्रयोग किया जा सकता है। सितम्बर लगभग किसी भी झिल्ली प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है, के रूप में लंबे समय के रूप में प्रोटीन समारोह और तस्करी गुण रखा जाता है। TIRF प्लाज्मा झिल्ली पर संकल्प को बढ़ाता है। सितम्बर में टैग परिधीय जालिका के भीतर उन से प्लाज्मा झिल्ली पर स्थित प्रोटीन के भेदभाव की अनुमति देता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 VWR 82050-856
35 mm glass bottom Petri dishes, sterile Cell E&G GBD00002-200
Poly-D-lysine vwr 215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), High Glucose Fisher Scientific 11-965-084 
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco / Fisher Scientific 31-985-088
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)  Gibco / Fisher Scientific 16-000-044
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Fisher Scientific 12604-021
Penicillin-Streptomycin Solution VWR 45000-652
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco / Fisher Scientific 21083027 Optional
Lipofectamine Fisher Scientific 11668030 Gently mix; Do not vortex
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-1
Potassium chloride Fisher Scientific P217-10
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214-500
Calcium chloride Fisher Scientific C79-500
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Objective immersion oil  Olympus Type F
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Microscope Olympus IX81
Camera Andor iXon Ultra 897
60X, 1.49 NA oil immersion objective Olympus APON 60XOTIRF
Motorized stage Prior IXPROXY
Motorized actuator (stepper motor) Thorlabs ZST213
MetaMorph (or other imaging program) Metamorph
488 nm laser Market Tech
Single mode fiber Thorlabs SM450
Mirrors Thorlabs BB1-E01
Dichroic 488 nm LP Semrock Di02-R488-25x36
Bandpass filter, 488 nm Semrock LL01-488-12.5
Bandpass filter, 525/50 Semrock FF03-525/50-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
  2. Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
  3. Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
  4. Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
  5. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  6. Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
  7. Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
  8. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
  11. Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
  12. Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
  13. Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
  14. Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
  15. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  16. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  17. Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
  18. Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
  19. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
  20. Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
  21. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  22. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
  23. Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).

Tags

बायोफिजिक्स अंक 121 Superecliptic pHluorin रिसेप्टर झिल्ली की तस्करी subcellular स्थानीयकरण प्लाज्मा झिल्ली प्रविष्टि कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी झिल्ली प्रोटीन अपरेगुलेशन
उपयोग pHluorin टैग रिसेप्टर्स subcellular स्थानीयकरण और अवैध व्यापार पर नजर रखने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fox-Loe, A. M., Henderson, B. J.,… More

Fox-Loe, A. M., Henderson, B. J., Richards, C. I. Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking. J. Vis. Exp. (121), e55466, doi:10.3791/55466 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter