Summary
여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs)는 전사 후 사슬 RNA 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA입니다. miRNA 발현 프로파일은 쥐의 다양한 기관과 조직에서 조사되었습니다. 그러나, miRNA의 정제 및 쥐 복막에서의 발현 검출을위한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 우리는 랫트 복막에서 정량적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 이용하여 miRNA를 정제하고 정량화하는 효과적이고 신뢰성있는 방법을 개발했다. 이 프로토콜은 4 단계로 구성되어 있습니다 : 1) 복막 샘플의 정화; 2) 복막 막 시료로부터의 miRNA를 포함하는 전체 RNA의 정제; 3) cDNA를 생산하기위한 miRNA의 역전사; 및 4) miRNA 발현을 검출하기위한 qRT-PCR. 이 프로토콜을 사용하여 6 개의 miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p)의 발현이 증가한 것을 성공적으로 확인했습니다.쥐 복막 섬유증 모델의 복막이 대조군에 비해 유의하게 높았다. 이 프로토콜은 많은 병리학 조건에서 쥐의 복막에서 miRNA 표현의 프로필을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs)는 전 사적으로 mRNA (messenger RNA) 발현을 조절하는 짧은 비 암호화 RNA입니다. miRNA의 발현 변화는 암, 염증, 대사 장애 및 섬유증 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8을 비롯한 다양한 병리학 적 조건에서 중추적 인 역할을하는 많은 mRNA의 발현을 조절합니다. 따라서 miRNA는 새로운 바이오 마커 및 치료 표적 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 로 잠재력이 있습니다. miRNA 발현 프로파일은 다양한 래트에서 결정되었다간, 심장, 폐 및 신장을 포함한 장기 및 조직 9 . 그러나, 랫 복막에서 miRNA의 정제 및 검출에 대한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다.
이 프로토콜의 전체 목표는 성공적으로 쥐의 복막에 miRNAs을 정화하고 감지하는 것입니다. 먼저, 유리 호 모지 나이저를 사용하여 복막 막 샘플을 균질화시킨 다음, 미세 원심 분리기 스핀 컬럼 10 에서 생체 고분자 파쇄 시스템에 노출시켰다. 다음으로, 실리카 막 기반 스핀 컬럼 10을 이용하여 복막 샘플로부터 miRNA를 포함한 total RNA를 정제 하였다. 이어서 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머 11을 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. 마지막으로, 삽입 염료 11을 사용하여 qRT-PCR에 의해 miRNA의 발현을 측정 하였다. 이 프로토콜의 이론적 근거는 b이전 연구에서 단순한 과정으로 조직에서 miRNA의 유의 한 정화 및 검출을 보여주었습니다 8 , 10 , 11 . 미세 원심 분리기 스핀 컬럼과 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하면 조직에서 고품질의 총 RNA를 정제 할 수 있다고보고되었습니다. 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머를 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하는 방법 및이 프로토콜에서 인터 칼 레이팅 염료를 사용하는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현을 검출하는 방법이 높은 정확성을 보인 것으로보고되었다. 감도 11 . 또한이 작업은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 프로세스입니다. 따라서이 프로토콜은 광범위한 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 miRNA의 매우 정확하고 민감한 검출을 필요로하는 연구에 유용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 얻었으며 Jichi Medical University Laboratory Animals 안내서의 Experimental Animals Use and Care of Animals 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 복막 샘플 수집
- 다음 품목을 수집하십시오 : isoflurane, 코르크 시트, 인산염 완충 식염수 (PBS), 수술 가위 및 포 셉과 페트리 접시에 흠뻑 목화와 50 ML 원심 분리기 튜브.
- Isofluorane의 과다 복용으로 쥐를 안락사시키고, 70 % 에탄올로 쥐의 복부 피부를 스프레이하고, 뒤에 코르크 시트에 쥐를 탑재.
- 가위와 포셉을 사용하여 복부 피부, 근육 및 복막에 세로 절개를하십시오.
- 포 셉를 사용하여 복막을 집어 들고, 다이어프램 아래의 가장 낮은 늑골을 따라 그 상단 부분에 수평 절개를하고,외과 용 가위를 사용하여 옆쪽 영역에있는 오우리어 쪽. 다음으로 외과 용 가위를 사용하여 몸에서 복막을 제거하기 위해 세로로 절개하십시오. 그런 다음 페트리 접시에 PBS로 씻으십시오.
- 외과 용 가위 및 집게를 사용하여 다음 단계에 적합한 크기 인 복막 막 샘플 20mg (3 ~ 5mm 2 )을 잘라내어 다듬습니다.
2. 복막 막 샘플로부터 전체 RNA 정제
참고 : 여기에 무게가 20mg 인 복막 샘플을 유리 호 모지 나이저 및 미세 원심 분리기 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하여 균질화합니다. 그런 다음 복막 막 샘플의 총 RNA를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 사용하여 분리합니다.
- 다음 항목을 수집하십시오 : 1.5 또는 2.0 ML microcentrifuge 튜브, 100 % 에탄올, 클로로포름, 유리 호 모지 나이저, 얼음, biopolymer - microcentrifuge 스핀 열 10 에서 시스템을 분쇄 10) , 페놀 / 구아니딘 계 용해제, 구아니딘과 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 1), 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 2)을 포함한다.
- 유리 호 모지 나이저에 20 MG 복막 샘플을 넣고 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약 700 μL를 추가합니다.
- 뒤틀린 상태에서 유봉을 천천히 눌러 시료를 균질화하십시오. 복막 막 샘플이 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 용해 될 때까지 얼음 위에서이 과정을 수십 번 반복합니다.
- 추가 균질, 2.0 ML 수집 튜브에 microcentrifuge 스핀 칼럼에 biopolymer - 파쇄 시스템에 균질 lysate을 전송합니다. 그런 다음 14,000 xg에서 4 분간 3 분간 원심 분리하십시오.
- Homogenized lysate를 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮긴다.
- 균질화 lysate에 클로로포름 140 μL를 추가하고 욕조를 모자안전하게. 그런 다음 튜브를 15 초 동안 뒤집어서 혼합하십시오.
- 실온에서 2-3 분 동안 샘플을 품어 낸다. 그런 다음 12,000 xg에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하십시오.
- 침전물을 방해하지 않고 상등액 (일반적으로 300 μL)을 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮기고 100 배 에탄올의 1.5 배량 (일반적으로 450 μL)을 첨가하십시오. 그런 다음 5 초 동안 볼 텍싱하여 샘플을 섞으십시오.
- 시료 700 μL를 2.0 mL 수집 튜브에 놓여있는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣으십시오. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다.
- 엄격하게 샘플을 씻어 실리카 막 기반 스핀 칼럼에 세척 버퍼 1 700 μL를 추가합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다.
- 실리카 멤에 세척 버퍼 2 500 μL를 추가하십시오rane 기반의 스핀 컬럼으로 소금의 흔적을 제거합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다.
- 2.11을 반복하십시오.
- 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 15,000 xg에서 1 분간 다시 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다.
- 새로운 1.5 ML 수집 튜브에 실리카 멤브레인 기반 스핀 칼럼을 놓습니다. 그런 다음 RNase가없는 물 25 μL를 컬럼으로 옮긴다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 샘플을 실온에서 5 분 동안 방치하십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 1 분간 원심 분리합니다.
- 총 RNA가 포함 된 25 μL 용리액을 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기십시오. 그런 다음 사용하기 전에 -80 ° C에서 보관하십시오.
3. 총 RNA의 역전사
참고 : 정량 실시간 PCR 실험의 출판을위한 최소 정보에 대한 참고 및 준수iments (MIQE) 지침은 더 나은 실습을 장려하고 신뢰성 있고 명확한 결과를 얻는 데 도움이됩니다.
참고 : 여기서 역전사 효소, poly (A) polymerase 및 oligo-dT primer를 사용하여 총 1.0 μg의 분리 된 RNA를 역전 사합니다.
- 다음 품목을 수집하십시오 : 1.5 mL microcentrifuge tubes; 8- 웰 스트립 튜브; RNase없는 물; 얼음; 역전사 효소 키트 (물질 표 참조) 11 .
- 2.0 μL의 10x 핵산 믹스, 2.0 μL의 역전사 효소 믹스 (키트에서), 4.0 μL의 5x hi-spec 버퍼를 포함하는 마스터 믹스 용액을 튜브 당 총 8.0 μL로 준비하십시오.
- 마스터 믹스 용액 (키트에서) 8.0 μL를 각 튜브에 분배합니다.
- 분광 광도계를 사용하여 전체 RNA 양을 측정하십시오. 복막 막 샘플에서 정제 된 분리 된 총 RNA 1.0 μg을 각 튜브에 첨가합니다.
참고 : qRT-PCR은 미국에서 수행 할 수 있습니다.정화 된 총 RNA의 품질 관리를 위해 역전사없이 전체 RNA를 주형으로 사용합니다. DNA가 오염되면 qRT-PCR에 의해 예상치 못한 증폭 산물이 관찰됩니다. - 총 20 μL까지 각 튜브에 RNase가없는 물을 첨가하십시오. 그런 다음 피펫 팅으로 철저히 혼합하고 15 초 동안 원심 분리하십시오.
- 37 ° C에서 60 분 동안 견본을 품어 라. 95 ° C에서 5 분간 즉시 품어 라.
참고 :이 단계는 열 순환 장치에서 수행 할 수 있습니다. - cDNA를 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기고 RNase가없는 물로 10 배 희석하십시오 (1:10).
- 희석 된 cDNA를 얼음에 일시적으로 보관하고 사용하기 전에 장기간 -80 ° C에서 보관하십시오.
4. miRNA의 qRT-PCR
참고 : miRNA의 qRT-PCR은 인터 칼 레이팅 염료를 사용하여 수행됩니다. 여기에는 RNA, U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p 프라이머 사용 된.
- 다음 항목을 수집 : 1.5 ML microcentrifuge 튜브, qRT - PCR, 96 - 웰 반응 플레이트에 대한 접착 필름, miRNA 특정 primers, 녹색 염료 기반의 PCR 키트 (자료 테이블을 참조하십시오) 11 에 대한 96 잘 반응 플레이트, 그리고 실시간 PCR 기기.
- 2x PCR 마스터 믹스 12.5 μL, nuclease-free 물에 용해 된 5 μM 각 miRNA 프라이머 2.5 μL 및 각 웰에 대한 10 배 범용 프라이머 1.25 μL가 들어있는 마스터 믹스를 준비하십시오.
- 96- 웰 플레이트의 각 웰에 22.5 μL의 마스터 믹스를 분배합니다.
- 각 우물에 2.5 μL의 template cDNA를 첨가한다.
- 96- 웰 반응 플레이트 용 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 그런 다음 플레이트를 1,000 xg에서 30 초간 원심 분리하십시오.
- 다음과 같이 실시간 PCR Instrument 및 소프트웨어로 PCR cycling 프로그램을 실행하십시오.
- 실시간 PCR 장비에 플레이트를 놓습니다. 실시간 PCR 소프트웨어에서 실험적 속성을 정의합니다 (실험적으로 입력이름, 악기의 실험 유형에 대한 "96 - 우물"을 선택, "SYBR 녹색 시약"대상 시퀀스를 감지하는 "SYBR 녹색 시약"을 선택 "2 - ΔΔCT 방법"을 선택하고, "표준 램프 속도"를 선택하십시오 악기 실행).
- 그런 다음 샘플에 이름을 지정하고 각 웰에서 miRNA를 표적으로 삼습니다. 샘플은 항상 결과 검증을위한 충분한 데이터를 얻기 위해 중복 또는 3 중으로 테스트됩니다. 표준 시료와 내인성 대조군을 선택하십시오. 염료가 수동 기준으로 사용하려면 "없음"을 선택하십시오.
- 지시에 따라 실시간 PCR 소프트웨어에 "20 μL"의 반응 부피와 다음의 PCR 사이클링 조건을 입력하십시오 : 95 ° C에서 15 분 동안 프리 인큐베이션 한 다음 94 ° C에서 15 초 동안 변성 55 ° C에서 30 초, 어닐링은 70 ° C에서 30 초 동안 수행 하였다.
- qRT-PCR 데이터 분석 u실시간 PCR 장비의 소프트웨어를 부릅니다. 소프트웨어에 의해 자동으로 결정되는 임계 값과 기준선이 각 우물에서 적절한 지 확인하십시오.
- 각 표본에서 표적 miRNA의 임계주기를 확인하십시오. 임계주기는 증폭 곡선과 임계 선 사이의 교차점입니다. 그런 다음, 내인성 대조군으로서 RNU6-2에 대한 표적 miRNA의 발현 수준을 표준화하고, 2 - ΔΔCT 방법 13을 사용하여 표적 miRNA의 상대 발현 수준을 계산한다.
참고 : 내인성 대조 miRNA의 발현 수준의 안정성을 확인해야합니다. 이 실험에서, RNU6-2는 높은 수준에서 각 그룹에 걸쳐 상대적으로 변하지 않는 것으로 확인되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기에 제시된 결과는 이전에보고 된 연구 8 에 근거합니다. 우리는 복막 섬유증에서 miRNA 발현 프로파일을 조사했다. 복막 섬유증은 복막 투석의 주요 합병증입니다. 그것은 mesothelial 세포 monolayer의 손실과 extracellular 매트릭스 구성 요소의 과도한 축적을 특징으로하고, 복막 막 실패 14 , 15 와 관련이 있습니다. 복막 섬유증 쥐 모델은 5 시간 동안 100 mL / kg 복막 투석액 (2.5 mM 글루코스, 100 mM NaCl, 35 mM 락트산 나트륨, 2 mM CaCl2 및 20 mM 메틸 글리 옥살 함유 0.7 mM MgCl2)의 복막 내 주사에 의해 제조되었다. 12 주령, 체중이 230-250 g 인 수컷 쥐에게 1 주일에 3 주간 3 주간 복용한다. 다음 그룹을 대조군으로 사용 하였다 : 어떠한 치료도하지 않은 쥐 (모의 쥐) 및 쥐를 주사 한 쥐메틸 글리 옥살 (대조군 쥐)이없는 복막 투석액. miRNA 마이크로 어레이 스크리닝에 기초하여 miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p의 6 가지 miRNA 이 원고 ( 그림 1 ) 8에 제시된 프로토콜에 따라 qRT-PCR을 사용하여 모의 쥐 및 대조군 쥐에 비해 복막 섬유증 쥐의 복막에서 유의하게 증가 하였다.
그림 1 : 복막 섬유 랫트의 복막 내 상향 조절 된 miRNA. 모의 실험 쥐 (n = 6)에서 miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p의 발현에 대한 qRT- , 대조군 쥐 (n = 6) 및 복막 섬유증 쥐 (n = 6). 값은 평균 ± 표준 오차 (오차 막대)입니다. 분산 분석(ANOVA)를 사용하여 그룹 간의 차이를 조사했습니다. ANOVA에 의해 통계적 유의성이 발견되면 Tukey의 검사를 두 그룹의 평균을 비교 한 사후 분석으로 수행했습니다. P 값이 0.05 미만인 차이는 유의 한 것으로 간주되었다. 약어 : qRT-PCR, 정량적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응; miRNAs, 마이크로 RNA; NS, 유의하지 않음; *, p <0.05. 이 수치는 Morishita et al. 8 (허락하에). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여, qRT-PCR을 사용하여 쥐 복막의 miRNA를 성공적으로 정제하고 검출 하였다. qRT-PCR 데이터 분석의 신뢰성은 정제 된 miRNA의 품질에 달려 있습니다. 따라서 miRNA의 순도는 분광 광도계를 사용하여 측정 할 수있는 280 nm에서의 흡광도 대 260 nm에서의 흡광도의 비율로 qRT-PCR 전에 확인할 수 있습니다. qRT-PCR을 사용하여 miRNA가 현저히 증폭되지 않으면 주형 cDNA의 농도가 증가 할 수 있습니다. 각 miRNA 특이 적 프라이머의 농도 또한 증가 될 수 있습니다.
microarray, Northern blotting 및 ribonuclease protection assay를 포함하여 miRNA 발현 수준을 결정하는 몇 가지 대체 방법이 있습니다. qRT-PCR은 노던 블 롯팅 또는 리보 뉴 클레아 제 보호 분석과 비교하여 최소량의 샘플을 필요로하는 민감하고 높은 처리량의 절차입니다. Microarrays는 exp의 수사를 가능하게합니다다수의 miRNA가 동시에 존재하며, 데이터는 일반적으로 qRT-PCR 17에 의해 얻어진 데이터와 강한 상관 관계를 나타낸다. 그러나 연구 집단 간의 마이크로 어레이 데이터 비교의 타당성을 확인할 수있는 방법론에 대한 합의는 이루어지지 않았다.
이 프로토콜에는 다음과 같은 제한 사항이 있습니다. 첫째,이 프로토콜에 의한 miRNA 검출의 검증은 간, 폐, 신장과 같은 다른 기관에서 검증되지 않았습니다. 둘째, 마우스, 햄스터, 개, 돼지 등 다른 실험 동물에서도 확인되지 않았다. biopolymer-shredding spin column과 silica-membrane-based spin column을 사용하여 miRNA를 정제하고 qRT-PCR을 사용하여 miRNA를 검출하는이 프로토콜의 플랫폼은 조직과 세포로부터 고품질의 RNA를 정제 할 수 있다고보고되었습니다. miRNA 발현 10 검출을위한 높은 정확도와 민감도, 11 . 우리는 또한 쥐 복막에서 miRNA 발현의 검출이이 프로토콜을 사용하여 성공적으로 수행 될 수 있음을 보여 주었다. 이 프로토콜은 광범위한 병리학 적 조건에서 쥐의 복막에서 miRNA 발현의 프로필을 조사하는 연구에 사용될 수 있습니다. 또한 많은 샘플은 간단한 과정을 포함하기 때문에이 프로토콜을 사용하여 함께 처리 할 수 있습니다. 따라서이 프로토콜은 복막의 다양한 병리학 적 조건에서 많은 miRNA의 발현 프로필을 분석해야하는 연구에 유용합니다.
이 프로토콜을 따를 때 몇 가지 중요한 사항을 염두에 두어야합니다. 첫째, 정제 된 RNA를 함유 한 시료는 분해를 피하기 위해 얼음 위에 놓아야합니다. 또한 열 분해로부터 RNA를 보호하기 위해 얼음 위에서 균질화 단계를 수행해야합니다. 또한, 복막 막 샘플은 그들이 공동 작용할 때까지 적절히 균질화되어야한다복막 막 샘플은 균질화에 의해 용해에 강한 실질적인 결합 조직을 함유하고 있기 때문에, 균질화를위한 컬럼 분쇄기의 사용이 권장된다. 둘째, 내인성 대조 miRNA의 발현 수준의 안정성은 qRT-PCR의 실험 설정을 통해 검증되어야한다. 이 절차가 사용될 수있는 다양한 병리학 적 조건이 결과를 손상시킬 수있는 내인성 대조 miRNA의 발현 수준에 영향을 줄 수 있기 때문에 이는 필요합니다.
결론적으로, 우리는 qRT-PCR을 이용한 래트 복막에서의 마이크로 RNA 발현의 정제 및 검출을위한 프로토콜을 기술 하였다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
그녀의 우수한 기술 지원에 대해 Miyako Shigeta에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS 가켄 (교부 번호 25461252)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N.
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
