Selectivamente marcado fluorescente GnRH-I, -II e -III derivados são ferramentas confiáveis para acompanhar e quantificar a sua captação celular. Este manuscrito apresenta experiências para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção destes conjugados da GnRH em várias linhas celulares.
análogos de GnRH são porções de direccionamento eficaz e capaz de entregar agentes anticancerígenos seletivamente em células tumorais malignas quais os receptores GnRH altamente expresso. No entanto, a análise quantitativa de captação celular análogos de GnRH 'e os tipos de células investigadas em sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH são actualmente limitada. Previamente introduzido, fluorescente marcado selectivamente GnRH I, -II e -III derivados fornecem grande detectabilidade, e eles têm propriedades químicas adequadas para experiências reprodutíveis e robustas. Descobrimos também que os métodos apropriados up-to-date com estes análogos de GnRH rotulados poderia oferecer novas informações sobre os sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH. Este manuscrito apresenta algumas experiências simples e rápido sobre a absorção celular de [D-Lys6 (FITC)] – a GnRH-I, [D-Lys6 (FITC)] – a GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] – GnRH -III na EBC-1 (pulmão), o BxPC-3 (pâncreas) e na Detroit-562- (faringe) T malignaUmor células. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, o nível da superfície celular de receptores de GnRH-I também foi examinada com estas linhas de células antes e após o tratamento com GnRH por microscopia confocal de varrimento laser. A absorção celular de conjugados da GnRH-FITC foi quantificada por separação de células activadas por fluorescência. Nestas experiências foi observada pequenas diferenças entre os análogos do GnRH e as principais diferenças entre os tipos de células. As diferenças significativas entre as linhas de células são correlacionados com o seu nível distinto de receptores de superfície celular GnRH-I. Os experimentos introduzidas contêm métodos práticos para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção de conjugados de GnRH-FITC em um tempo e forma dependente da concentração em várias culturas de células aderentes. Esses resultados poderiam predizer a eficácia da segmentação de drogas de conjugados de GnRH na cultura celular dado, e oferecem uma boa base para novas experiências no exame dos sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH.
Sistemas de entrega de drogas específicas base de péptidos tornaram-se um desenvolvimento rápido e a área promissor na terapia do cancro ao longo dos últimos anos um, 2. Gonadotropina humana tipo I libertando receptor da hormona (GnRH-IV) situa-se principalmente na glândula pituitária, mas também está presente em vários outros tecidos que são responsáveis por auto-reprodução 3. GnRH-IV é também expressa num número de tecidos de cancro, relacionada ou não com o sistema reprodutivo 4, 5. A expressão elevada de GnRH-IR em várias células de tumores malignos em comparação com tecidos saudáveis fornece uma oportunidade para terapia alvo 5, 6.
Muitos hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) análogos têm sido desenvolvidos nas últimas décadas, que poderiam ser utilizados como porções de direccionamentof "> 7, 8, 9. Estes péptidos são capazes de entregar agentes anticancerígenos com elevada selectividade para as células tumorais malignas que sobre-expressa a GnRH-IV 6. Vários fármacos anti-tumorais conjugados da GnRH com maior selectividade e maior eficiência do que o não conjugado correspondendo livre de drogas foram relatados 7, 8, 9.
Publicações anteriores cerca de péptidos da GnRH e seus receptores relatado que a GnRH-IR pode assumir várias conformações diferentes que têm selectividade para GnRH análogos 10. A GnRH-IR altamente variável tem complexos e várias vias de sinalização são dotados de actividade diferente contra os seus ligandos naturais e artificiais 11. Estes fatos fazem investigação de sistemas baseados em GnRH desafiador. Por outro lado, o y possuem potencial terapêutico promissor. Várias experiências com péptidos GnRH radiomarcados foram anteriormente relatados 12, 13, 14, 15, mas experimentos nos quais foram usados análogos de GnRH fluorescente etiquetado ainda são limitados. Enquanto marcação radioactiva oferece alta sensibilidade, marcação fluorescente tem várias outras vantagens, por exemplo, o manuseio mais fácil, ea capacidade de contracoloração com diferentes fluoróforos. Três análogos de GnRH comuns que têm sido utilizados com sucesso para a entrega de drogas são a [D-Lys6] -GnRH-I, [D-Lys6] -GnRH-II e III-GnRH, mas a eficácia destes péptidos como porções de direccionamento é raramente comparado 16, 17. Por outro lado, os resultados obtidos em experiências separadas em que foram utilizadas células de cancro diferentes e os análogos da GnRH é diversa.
ntent "> Com base nestas considerações, nós nos concentramos em que o tumor alvo e potencial de entrega da droga destes péptidos GnRH e, assim, sintetizada e caracterizada a [D-Lys 6 (ITCF)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – a GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] – conjugados peptídicos de GnRH-III 18 Estes análogos são marcados selectivamente com FITC na cadeia lateral do seu (razão de péptido-FITC Lys ou D-Lys 1: 1 em cada um. conjugado). a ideia era que a marcação fluorescente seletivo pode oferecer novas informações sobre esses peptídeos, e permite que sua boa localização e quantificação confiável. estes conjugados têm um manuseamento seguro e detecção confiável, o que tornará mais fácil para comparar sua eficiência segmentação tumor, ea triagem de numerosos tipos de células tumorais malignas. esperamos que up-to experimentos data com estes conjugados peptídeo poderia contribuir para o desenvolvimento de câncer de romance alvo conjugados GnRH-drogas, e ajudar a identificar novos tar terapêuticafica bem.O presente artigo propõe demonstrar algumas experiências bem reprodutíveis e rápidos com conjugados de GnRH-FITC. A expressão na superfície celular da GnRH-R é uma condição determinante sobre a absorção de GnRH, por isso investigado simultaneamente o nível da superfície celular da GnRH-IR sobre as linhas de células testadas. Nós visualizados os conjugados da GnRH-IR e GnRH-FITC por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) e quantificado a absorção celular de conjugados da GnRH-FITC utilizando células activadas por fluorescência (FACS).
As experiências aqui descritas usar análogos de GnRH marcadas seletivamente para o rastreio aderente culturas de células in vitro. A microscopia confocal e métodos de citometria de fluxo são adequados para controlar e quantificar a absorção celular destes conjugados da GnRH-FITC em um momento e de modo dependente da concentração. Estas experiências têm os seguintes passos críticos: 1) manter uma cultura de células estéril e saudável; 2) péptidos GnRH deve ser de elevada qualidade; 3) …
The authors have nothing to disclose.
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
[Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |