En Vitro Imágenes y cuantificación de la eficiencia de la focalización de Drogas de los análogos de GnRH marcado con fluorescencia
Summary
Selectivamente la etiqueta fluorescente GnRH-I, II y III Los derivados son instrumentos fiables para el seguimiento y la cuantificación de la captación celular. Este manuscrito introduce experimentos para visualizar, cuantificar y comparar la eficiencia de absorción de estos conjugados de GnRH en diversas líneas celulares.
Abstract
análogos de GnRH son eficaces restos de dirección y capaz de administrar agentes anticancerígenos selectivamente en células tumorales malignas que los receptores de GnRH altamente exprés. Sin embargo, el análisis cuantitativo de la captación celular de GnRH análogos 'y los tipos de células investigadas en los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH se limitan actualmente. Previamente introducida, marcado fluorescente selectivamente GnRH I, II y III derivados proporcionar gran capacidad de detección, y tienen propiedades químicas adecuadas para experimentos reproducibles y robustos. También se encontró que los métodos apropiados en marcha hasta la fecha con estos análogos de GnRH etiquetados podrían ofrecer nueva información sobre los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH. Este manuscrito presenta algunos experimentos simples y rápidas con respecto a la captación celular de [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-II y [Lys 8 (FITC)] – GnRH -III en la EBC-1 (pulmón), el BxPC-3 (páncreas) y en el Detroit-562- (faringe) t malignoumor células. En paralelo con estos conjugados GnRH-FITC, el nivel de la superficie celular de los receptores de GnRH-I también fue examinado en estas líneas celulares antes y después del tratamiento con GnRH por microscopía confocal de barrido láser. La absorción celular de conjugados de GnRH-FITC se cuantificó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. En estos experimentos se observó diferencias menores entre los análogos de la GnRH y las principales diferencias entre los tipos de células. Las diferencias significativas entre las líneas celulares se correlacionan con su nivel distinto de los receptores de la superficie celular GnRH-I. Los experimentos introducidas contienen métodos prácticos para visualizar, cuantificar y comparar la eficiencia de absorción de los conjugados GnRH-FITC en un tiempo y manera dependiente de la concentración en diferentes cultivos de células adherentes. Estos resultados podrían predecir la eficacia de dirección de fármaco de conjugados de GnRH en el cultivo celular dado, y ofrecer una buena base para futuros experimentos en el examen de los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH.
Introduction
Sistemas de administración dirigida de fármacos a base de péptidos se han convertido en un desarrollo rápido y área prometedora en la terapia del cáncer en los últimos años 1, 2. Gonadotropina humana tipo liberación de receptor de la hormona I (GnRH-IR) se encuentra principalmente en la glándula pituitaria, pero también está presente en varios otros tejidos que son responsables de autorreproducción 3. GnRH-IR también se expresa en una serie de tejidos de cáncer, relacionados o no con el sistema reproductivo 4, 5. La elevada expresión de GnRH-IR en varias células tumorales malignas en comparación con los tejidos sanos proporciona una oportunidad para que la terapia dirigida 5, 6.
Muchos hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) se han desarrollado en las últimas décadas, que podrían ser utilizados como restos de direccionamientof "> 7, 8, 9. Estos péptidos son capaces de administrar agentes anticáncer con alta selectividad en células tumorales malignas que sobre-expresa GnRH-IR 6. Varios fármacos anti-tumorales conjugados de GnRH con una mayor selectividad y una mejor eficiencia de la no conjugada correspondiente fármaco libre se ha informado de 7, 8, 9.
Publicaciones anteriores sobre los péptidos de GnRH y sus receptores informaron que la GnRH-IR puede asumir diversas conformaciones que tienen una selectividad diferente para la GnRH análogos 10. La GnRH-IR altamente variable ha vías de señalización complejos y diversos están dotados de actividad diferente en contra de sus ligandos naturales y artificiales 11. Estos hechos hacen investigación de sistemas basados en GnRH desafiante. Por otra parte, la y poseen potencial terapéutico prometedor. Varios experimentos con péptidos GnRH radiomarcados se informó anteriormente 12, 13, 14, 15, pero los experimentos en los que se utilizaron los análogos de GnRH marcados con fluorescencia son todavía limitada. Si bien el etiquetado radiactivo ofrece alta sensibilidad, etiquetado fluorescente tiene varias otras ventajas, por ejemplo, el manejo más fácil, y la capacidad de contratinción con diferentes fluoróforos. Tres análogos de GnRH comunes que con éxito han sido utilizados para la administración de fármacos son el [D-Lys 6] GnRH-I, [D-Lys 6] GnRH-II y III-GnRH, pero la eficacia de estos péptidos como restos de direccionamiento es raramente en comparación 16, 17. Por otra parte, los resultados de experimentos separados en los que se utilizaron diferentes células cancerosas y análogos de la GnRH es diversa.
ntent "> Sobre la base de estas consideraciones, se centró en el tumor de orientación y el potencial de suministro de medicamento de estos péptidos de GnRH y de este modo sintetizado y caracterizado la [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – GnRH-II y [Lys 8 (FITC)] – conjugados de péptido GnRH-III 18 Estos análogos están etiquetados selectivamente con FITC en la cadena lateral de su (relación de péptido-FITC Lys o D-Lys 1: 1 en cada uno. conjugado). la idea era que el etiquetado fluorescente selectiva puede ofrecer información novedosa de estos péptidos, y permite su buen seguimiento y cuantificación fiable. estos conjugados tienen una manipulación segura y detectabilidad fiable, que hacen que sea más fácil de comparar la eficiencia de la orientación del tumor, y la la detección de numerosos tipos de células tumorales malignas. esperamos que se ponga a experimentos hechos con estos conjugados peptídicos podría contribuir al desarrollo de cáncer de novela de orientación conjugados GnRH con las drogas, y ayudará a identificar nuevas alquitrán terapéuticaconsigue así.El presente manuscrito demuestra algunos experimentos reproducibles y rápidos con conjugados GnRH-FITC. La expresión de la superficie celular de GnRH-R es una condición determinante en cuanto a la absorción de GnRH, por lo que simultáneamente investigó el nivel de la superficie celular de GnRH-IR en las líneas celulares ensayadas. Estamos visualizar los conjugados de GnRH y GnRH-IR-FITC por microscopía confocal de barrido láser (CLSM) y se cuantificó la captación celular de conjugados de GnRH-FITC usando células activadas por fluorescencia (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los experimentos descritos en este documento utilizar análogos de la GnRH marcadas selectivamente para adherente cribado cultivos de células in vitro. La microscopía confocal y citometría de flujo métodos son adecuados para el seguimiento y la cuantificación de la captación celular de estos conjugados de GnRH-FITC en un tiempo y manera dependiente de la concentración. Estos experimentos tienen los siguientes pasos críticos: 1) mantener un cultivo celular estéril, sana; 2) péptidos GnRH deb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
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